棕榈酸钠、油酸钠对原代肝细胞脂质沉积、氧化应激及AMPK信号通路相关基因表达影响的研究

棕榈酸钠、油酸钠对原代肝细胞脂质沉积、氧化应激及AMPK信号通路相关基因表达影响的研究

赵婉芯、陈超/中国家禽（Ei ,中文核心期刊）

1. 前言

油酸和棕榈酸是脂肪肝血清中含量最丰富的游离脂肪酸，是动物食品中不可缺少的油脂组成，油酸和棕榈酸在日常膳食中均以浓度摩尔比2∶1存在，在肥肝的发生和发展中有重要作用。研究表明，油酸和棕榈酸可以诱导细胞内脂质沉积，使细胞发生变性，油酸和棕榈酸可以增强大鼠大脑的氧化损伤，并诱导细胞产生氧化应激，但脂肪酸影响肝细胞特定的分子机制尚不明确。

油酸与棕榈酸常用来诱导原代肝细胞转化成脂肪肝细胞模型，模仿大鼠、小鼠和人等哺乳动物高脂营养摄入下的情况。现有技术中，肖晴和Long等使用棕榈酸诱导形成小鼠肝细胞成脂肪肝模型，检测甘油三酯和脂滴含量，谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平等筛选适宜模型。Luo等通过单用油酸、油酸与异弈杂素联用诱导大鼠肝细胞，成功构建脂肪肝细胞模型。王辉等通过脂肪酸诱导人肝细胞发现，脂肪酸对肝细胞的存活率和凋亡率均有影响且显著上调脂代谢相关基因。

本研究利用复合脂肪酸诱导的骡鸭原代肝细胞脂质沉积模型，筛选出最适复合酸比例，模拟骡鸭肥肝的生物学过程，探究骡鸭肥肝形成过程中的机制，为构建骡鸭原代肝细胞脂质沉积模型和肥肝的生产过程中油脂添加配比提供参考。

2.实验材料

本文中复合酸：油酸钠、棕榈酸钠、棕榈酸、油酸等游离脂肪酸均源自西安鲲创科技发展有限公司（Xi'an Kunchuang Technology Development Co., Ltd）。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、无菌、常温无析出、低温无析出、浓度精准，而且无需多次加热助溶，显著减少了操作步骤，提升了实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。

3. 复合脂肪酸诱导原代肝细胞脂质沉积模型建立

1）CCK-8法检测细胞活力

骡鸭原代肝细胞接种在96孔板，铺板密度约为1×10⁵个细胞/mL。加入不同浓度梯度复合脂肪酸（油酸+棕榈酸浓度分别为0μmol/L，500μmol/L+250μmol/L，1000μmol/L+500μmol/L，1500μmol/L+750μmol/L，2000μmol/L+1000μmol/L的DMEM完全培养基），诱导培养12h、24h、36h、48h。按细胞增殖毒性检测（CCK-8）试剂盒说明书操作，每100μL培养基添加20μL的CCK-8试剂。在37℃、5%CO₂培养箱孵育75min。酶标仪测定OD_450nm值。

2）油红O染色检测脂滴含量

骡鸭原代肝细胞接种在24孔板，铺板密度约为5×10⁵个细胞/mL。加入不同浓度梯度复合脂肪酸（油酸+棕榈酸浓度分别为0μmol/L，500μmol/L+250μmol/L，1000μmol/L+500μmol/L，1500μmol/L+750μmol/L，2000μmol/L+1000μmol/L的DMEM完全培养基），倒置显微镜观察油红O染色12h、24h、36h、48h的肝细胞脂滴情况。

4. 复合脂肪酸诱导肝细胞氧化应激

活性氧含量：按上述脂肪酸浓度分组处理36h，按照1∶1000稀释DCFH-DA染色液至10μmol/L；加入染色液后37℃孵育20min。无血清培养基洗涤5次。采用流式细胞仪检测DCFHDA荧光强度。丙二醛含量：按试剂盒使用说明对骡鸭原代肝细胞中丙二醛含量进行检测，用酶标仪测定532nm处OD值。谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性：按试剂盒使用说明对添加复合脂肪酸36h的细胞中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性进行检测，用酶标仪测定510nm处OD值。

5.实验结果分析

1）肝细胞糖原及脂滴检测

通过过碘酸-雪夫（PAS）染色法和油红O染色法鉴定培养24、36、48h的原代肝细胞，红色箭头处可见细胞质中的洋红色颗粒，苏木素染色细胞核呈现浅蓝色（见图1红色箭头）。油红O染色法使肝细胞分泌的脂滴被染成红色。

图1骡鸭原代肝细胞油红O染色

2）复合脂肪酸对骡鸭原代肝细胞增殖活力的影响

由图2可知，添加复合脂肪酸处理肝细胞12h，与对照组相比，复合酸浓度增高细胞活力无显著差异（P>0.05）；处理24h，与对照组相比，除500μmol/L+250μmol/L组，其余处理组均随复合脂肪酸浓度增高细胞活力显著上调（P<0.05）；处理36h，与对照组相比，2000μmol/L+1000μmol/L组细胞活力显著下降（P<0.05），而1500μmol/L+750μmol/L组虽下降但无显著差异（P>0.05），细胞活性还保持80%以上。

图2 复合脂肪酸对骡鸭原代肝细胞活力的影响

3）复合脂肪酸对骡鸭原代肝细胞脂滴含量的影响

由图3可知，与对照组相比，添加复合脂肪酸处理肝细胞12h、24h、36h、除500μmol/L+250μmol/组，其余处理组均随复合脂肪酸浓度增高各脂滴含量呈显著上调趋势（P<0.05）；处理48h，脂滴含量呈先上升后下降的趋势。总的来说，培养36h、1500μmol/L+750μmol/L组脂滴含量均显著高于其他组（P<0.05）。

图3 复合脂肪酸对骡鸭原代肝细胞脂滴含量的影响

图3中，可以观察到Lira可能通过上调Sirt1/AMPK通路，显著降低了PA处理的HepG2细胞SREBP1c蛋白表达，而干扰Sirt1时，Lira可部分激活LKB1/AMPK通路改善肝脏脂肪变性。Lira改善HepG2细胞脂质代谢，有效地缓解了肝细胞脂肪变性，其机制可能与上调了Sirt1/AMPK基因表达有关。

4）复合脂肪酸诱导骡鸭原代肝细胞氧化应激

与对照组相比，复合脂肪酸处理组细胞活性氧荧光强度水平和丙二醛含量显著提高（P<0.05）。1000μmol/L+500μmol/L、1500μmol/L+750μmol/L和2000μmol/L+1000μmol/L组细胞活性氧荧光强度和丙二醛含量随复合酸浓度升高显著上调（P<0.05）。与对照组相比，处理36h，1500+7500μmol/L和2000+1000μmol/L复合脂肪酸组谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著升高（P<0.05）。

小编有话说：

本研究详细阐述了油酸与棕榈酸最佳作用范围的摸索过程，最终通过油酸和棕榈酸浓度2∶1进行诱导原代骡鸭肝细胞使其产生脂质沉积，筛选出处理36h、油酸+棕榈酸浓度为1500μmol/L+750μmol/L的复合酸浓度组脂滴含量丰富且细胞活力80%以上，可以选取该条件来构建骡鸭原代肝细胞脂质沉积模型。本试验对构建成功的骡鸭原代肝细胞脂质沉积模型的氧化应激和超微结构检测显示，模型细胞表现出肝脏氧化应激，脂质过氧化产物，线粒体呼吸链功能缺陷，活性氧产生时出现线粒体功能障碍，β-氧化水平降低，脂肪生成增加，肝细胞内脂质堆积，产生活性氧和肝细胞损伤，而线粒体功能障碍是导致肥肝产生的关键因素，具有一定参考价值。

参考文献

赵婉芯，陈超，黄彩云. 复合脂肪酸对骡鸭原代肝细胞脂质沉积及AMPK信号通路的影响[J]，中国家禽，2024(10).