Redox Biology（IF/10.7）：棕榈酸诱导AML12肝细胞脂质堆积模拟NASH脂毒性微环境

Redox Biology（IF/10.7）：棕榈酸诱导AML12肝细胞脂质堆积模拟NASH脂毒性微环境

1. 前言

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是慢性肝病的重要形式，其核心病理机制包括肝脂肪堆积、炎症反应和纤维化。肝巨噬细胞分泌的促炎因子肿瘤坏死因子（TNF）和白介素1β（IL1β）在疾病进展中起关键作用。然而，系统性抑制这些因子的传统疗法常伴随副作用，亟需靶向递送策略。外泌体因其天然靶向肝脏巨噬细胞的特性及高生物相容性，成为理想的药物载体。本研究聚焦于通过外泌体递送TNF反义寡核苷酸（ASO-TNF）或糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2DG），靶向抑制巨噬细胞炎症因子表达，探索其治疗潜力及机制。

实验采用骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和RAW264.7巨噬细胞，通过脂多糖（LPS）刺激模拟炎症状态，评估外泌体递送ASO-TNF或2DG对TNF/IL1β表达的抑制作用（qRT-PCR、Western blot）。AML12肝细胞与巨噬细胞条件培养基共培养，结合棕榈酸（PA）诱导脂质堆积，通过油红O染色和甘油三酯检测分析脂质代谢变化。此外，通过siRNA敲低Sod1验证其在脂质积累中的调控作用。

2.高脂细胞添加剂

文中采用棕榈酸（Palmitic Acid）作为高脂细胞添加剂（货号KC003，Kunchuang Science and Technology Development, 鲲创科技发展）作为游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）处理细胞。

针对AML12肝细胞，部分研究人员会单独使用棕榈酸（钠）或油酸（钠）进行诱导，由于肝细胞本身较为敏感，某些情况下单独使用其中一种脂肪酸也能获得理想的实验结果。然而，从机制上讲，棕榈酸（钠）主要诱导细胞损伤和炎症反应，而油酸（钠）主要促进细胞脂质沉积。因此，在研究非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）时，更推荐采用棕榈酸（钠）与油酸（钠）联合诱导的技术方案，不仅能更好地模拟人体内的病理生理环境，还能提高实验结果的可靠性和科学性。推荐油酸高脂试剂盒（KC006），该试剂盒包括了棕榈酸（钠）、油酸（钠）和溶剂对照，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，浓度准确，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

3.细胞处理及部分实验结果

研究首先通过分析公共数据库（如GSE167523和GSE119340）证实NASH患者和小鼠模型中TNF/IL1β显著上调，且主要来源于肝巨噬细胞（图1A-C）。体外实验中，BMDMs和RAW264.7细胞经LPS刺激后，2DG处理可同时抑制TNF和IL1β的mRNA及蛋白表达（图1D-F），而ASO-TNF特异性降低TNF水平（图1E-F），表明两种药物对炎症因子的选择性调控。外泌体载药后，透射电镜（图2C）和纳米颗粒追踪分析（图2B）显示其形态与尺寸未受显著影响，且标志蛋白Alix、Tsg101高表达（图2D），证明载药过程未破坏外泌体完整性。

图1 ANXA1在糖尿病牙周炎中随巨噬细胞的增生而降低。2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）或抗TNF反义寡核苷酸（ASO-TNF）可降低巨噬细胞TNF和/或IL-1β的表达。(A)基因表达综述（NAFLD患者，NAFL=51，NASH=47）中转录组数据集GSE167523的人肝脏中TNF和IL1β的表达分析。(B)来自转录组数据集GSE119340的喂食饲料和NASH诱导小鼠肝脏中TNF和IL1β表达的分析。(C)使用scRNAseq数据集GSE129516进行点图分析，以评估肝细胞群中TNF和IL1β的表达水平。(D)RAW264.7细胞或骨髓基质细胞用2DG（2mM）和脂多糖（LPS，200ngmL⁻¹）处理24h，并使用qRT-PCR检测TNF和IL1β的表达。(E)用ASO-TNF（100nM）转染RAW264.7细胞或BMDM18-24小时，然后用LPS刺激24小时，并使用qRT-PCR测定TNF的表达。(F)用2DG或ASO-TNF处理RAW264.7细胞，以Gapdh为对照，Westernblot检测TNF和/或IL-1β的表达。

图2 ASO-TNF或2DG可负载exosome。(A)负载ASO-TNF或2DG的外来体示意图。(B)通过纳米颗粒示踪分析（NTA）测定bEnd.3衍生的外来体的大小分布。(C)用透射电镜（TEM）观察外源体的形态。(D)Western blot检测bEnd.3细胞裂解液和exosome中阿利克斯、Tsg 101、Flotillin-1和Vdac 1的表达水平。(E)将BMDM与载有德克萨斯红标记和胆固醇修饰的寡核苷酸的外来体（1 μg外来体/10 pmol ODNs）一起孵育。12小时后，用抗小鼠F4/80抗体对BMDM进行染色，并通过荧光显微镜进行分析。细胞核用DAPI复染。(F)将胆固醇修饰的乱序miRNA（NC）或miR-188- 5 p模拟物（miR）与exosomes孵育，并通过qRT-PCR检测exosomes中miR-188- 5 p的水平，以U6作为参考对照。(G)用电穿孔法将2DG（0.6M 2DG VS 100 μg exosomes）负载到exosomes中，用葡萄糖氧化酶法测定exosomes中2DG的浓度。

进一步实验显示，负载Texas红标记ODN的外泌体可高效递送至巨噬细胞（图2E），而电穿孔载入的2DG浓度达400pmol/μg（图2G）。体外共培养中，Exo/ASO-TNF或Exo/2DG显著降低LPS刺激后巨噬细胞的TNF/IL1β表达（图3A-C），且Exo/2DG促进M2极化标志物Arg1和IL10上调（图S2B）。通过条件培养基（CM）转移实验，发现经Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理的巨噬细胞CM可减少AML12肝细胞中PA诱导的脂滴积累（图4B-D），而外源性添加TNF/IL1β部分逆转此效应，证实炎症因子直接驱动脂质沉积。

图3 Exo/ASO-TNF或Exo/2DG在体内外均能抑制巨噬细胞TNF和/或IL 1 β的表达。(A-B)将BMDM与Exo、Exo/2DG、Exo/ASO-Control（Exo/ASO-CT）或Exo/ASO-TNF孵育24 h，然后更换并与含有LPS（200 ng mL⁻¹）的新鲜培养基一起再培养24 h，并通过qRT-PCR检测TNF和IL 1 β的表达。(C)将RAW264.7巨噬细胞与Exo、Exo/2DG、Exo/ASO-CT或Exo/ASO-TNF共同孵育24 h，然后用LPS（200 ng mL⁻¹）处理24 h，通过Western blot检测TNF和IL 1 β的表达，以微管蛋白作为参考对照。(D)将DiI标记的外泌体（200 μg）通过尾静脉注射到喂食MCD的小鼠中。6 h后，使用生物发光成像检查肝、肺、脾、肾和心脏中的DiI信号。(E)用抗小鼠F4/80抗体染色肝切片，并通过荧光显微镜进行分析。细胞核用DAPI复染。(F)用MCD饲料喂养小鼠4周，并在最后2周通过尾静脉向小鼠注射Exo/ASO-TNF或Exo/2DG（200 μg）4次。使用磁激活细胞分选（MACS）分离F4/80+肝巨噬细胞。流式细胞仪检测F4/80+细胞纯度。(G)通过qRT-PCR测量F4/80+肝巨噬细胞中TNF和IL 1 β的mRNA水平。

图4 Exo/ASO-TNF或Exo/2DG在体外减弱原代肝细胞中的脂质蓄积。(A)示意图显示BMDM用Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理1天，更换并用含有LPS的新鲜培养基培养1天，并收获条件培养基（CM）。然后，在存在或不存在TNF（10ngmL⁻¹）和/或IL1β（10ngmL⁻¹）的棕榈酸培养基（PA，200μM）中，将原代小鼠肝细胞与CM一起培养2天。(B)使用油红O染色评估原代肝细胞中的脂质蓄积。(C)对（B）组油红O染色阳性面积进行定量比较。

机制层面，RNA测序显示Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理后肝组织氧化磷酸化通路激活，炎症通路抑制。Sod1作为关键抗氧化酶，其表达在治疗组显著上调，且敲低Sod1可抵消外泌体对脂质积累的改善作用。此外，TNF通过激活JNK通路抑制Sod1表达，而外泌体治疗降低肝组织pJNK水平，揭示其通过抑制JNK-Sod1轴调控氧化应激与脂代谢。

4.总结

炎症介质肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素1 β（IL 1 β）主要来源于肝脏中的肝巨噬细胞，在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的进展中起着至关重要的作用。同时，静脉注射的外泌体主要分布在肝脏中，并且主要被肝巨噬细胞摄取。在此，旨在评估通过外泌体靶向抑制肝巨噬细胞中TNF和IL 1 β表达作为NASH潜在治疗策略的可行性。本研究证明，TNF反义寡核苷酸（ASO-TNF）或2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）能有效抑制巨噬细胞TNF和/或IL 1 β的表达。ASO-TNF或2DG负载的Exosomes在体内外均能抑制巨噬细胞TNF和/或IL 1 β的表达。此外，输注Exo/ASO-TNF或Exo/2DG显著减轻了胆碱缺乏氨基酸定义（CDAA）或蛋氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食喂养小鼠的实验性脂肪性肝炎。RNA-seq结果显示，用Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理显著抑制促炎信号通路。机制上，我们观察到给予Exo/ASO-TNF或Exo/2DG可以通过上调超氧化物歧化酶1（Sod 1）的表达来减弱NASH进展。总之，研究结果表明，输注载有ASO-TNF或2DG的外泌体减轻了小鼠模型中的实验性脂肪性肝炎。因此，输注载有抗炎剂的外来体有望成为NASH治疗的潜在治疗策略。

小编有话说：

在体外细胞实验中，使用200μM的棕榈酸（PA）、48h诱导AML12肝细胞脂质堆积，以模拟NASH的脂毒性微环境。外泌体递送ASO-TNF或2DG通过抑制巨噬细胞炎症因子分泌，间接减少肝细胞脂滴形成，且这一效应依赖于Sod1介导的抗氧化机制。实验中的细胞处理涵盖巨噬细胞炎症调控、肝细胞脂质代谢分析及基因敲低验证，凸显外泌体靶向递送在多细胞交互中的核心作用。高脂细胞添加剂（Kunchuang Science and Technology）在NASH模型中不可或缺，其稳定性为疾病机制研究提供可靠工具。未来，结合外泌体的精准递送系统与优质脂质诱导试剂，有望加速抗NASH药物的开发与转化，为肝病治疗开辟新路径。

参考文献

He,F. , Du,W. , Liu,Y. ,et al.J. Exosome-equipped TNF antisense oligodeoxynucleotide or 2-deoxy-D-glucose ameliorated nonalcoholic steatohepatitis by modulating superoxide dismutase 1 in mice.Redox Biology, 2025. https://doi.org/10.1016/j.redox.2025.103488