棕榈酸(PA)诱导人肝癌细胞(HepG2)脂肪蓄积以建立细胞脂肪变性模型

棕榈酸(PA)诱导人肝癌细胞(HepG2)脂肪蓄积以建立细胞脂肪变性模型

路瑶等/实用肝脏病杂志

1. 前言

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是以肝实质细胞脂肪蓄积和脂肪变性为特征的一种代谢紊乱性疾病。现有多数文献中记载了：胰高血糖素样肽-l（GLP-1）受体激动剂（Ra），如降糖药物利拉鲁肽（Lira）既能改善肝脂肪变性及胰岛素抵抗，还可抑制饱食中枢、延缓胃排空。本研究应用棕榈酸（palmitic acid，PA）诱导的HepG2细胞，观察Sirt1抑制剂和Lira干预后肝细胞Sirt1/AMPK/SREBP1c通路及脂质合成相关分子表达水平的变化，为临床上治疗NAFLD选择靶点提供更多的理论依据。

2.实验材料

本文以人肝癌细胞（HepG2细胞）为对象，采用棕榈酸高脂细胞添加剂（KC003，Xi'an Kunchuang Biotechnology， China）作为游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs），完成体外细胞实验。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、无菌、常温无析出、低温无析出、浓度精准，而且无需多次加热助溶，显著减少了操作步骤，提升了实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。

3. 实验方法

1）细胞模型的建立与分组干预

取HepG2细胞，用含10%胎牛血清、1%双抗（青链霉素）的DMEM培养基在95% O₂，5% CO₂，37℃培养箱中培养。

1）对照组:不做任何药物处理，等量加入溶剂对照；

2）PA组:加入0.25 mmol/L PA处理HepG2细胞24h； 

3）PA/Lira组:加入0.25 mmol/L PA和100nmol/L Lira干预；

4）PA/Sirt1组:加入0.25 mmol/L PA和50μmol/L EX527干预；

5）PA/Sirt1/Lira组:加入0.25 mmol/L PA、50μmol/L EX527和100nmol/L Lira干预24 h。

2）细胞脂肪变性检测

采用油红O染色。取细胞加入60%异丙醇滴洗，加油红O染色，冲洗去染液，晾干，镜检。应用Image Proplus 6.0软件分析染色结果，根据图片脂滴的累积数量，计算累积光密度，每组取3张玻片，取均值。

此外，细胞上清液NAD+/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）检测采用WST-8法检测。收集各组细胞及上清液，参考NAD+/NADH、ALT、AST、TG试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪检测。

4.实验结果分析

1）各组肝细胞脂滴沉积比较

对照组肝细胞内可见细小脂滴；PA处理组肝细胞内见大量脂滴；PA/Lira处理组肝细胞脂滴数量减少；PA/Sirt1组脂滴更大，沉积明显；PA/Sirt1/Lira组脂滴数量明显减少（图1）。

图1各组肝细胞内脂滴沉积变化（油红O染色，400×）左至右：正常对照组；PA组；PA/Lira组；PA/Sirt1组；PA/Sirt1/Lira组

2）各组细胞p-AMPK、p-Sirt1和p-SREBP1c蛋白表达比较

与对照组比，PA组细胞p-AMPK和p-Sirt1蛋白表达下调，而SREBP1c表达上调；与PA组比，PA/Lira组p-AMPK蛋白表达上调而SREBP1c蛋白表达下调；与PA/Sirt1组比，PA/Sirt1/Lira组细胞p-AMPK表达上调（图2）。

图2 各组细胞p-AMPK、p-Sirt1和p-SREBP1c蛋白表达比较

图2中，可以观察到Lira可能通过上调Sirt1/AMPK通路，显著降低了PA处理的HepG2细胞SREBP1c蛋白表达，而干扰Sirt1时，Lira可部分激活LKB1/AMPK通路改善肝脏脂肪变性。Lira改善HepG2细胞脂质代谢，有效地缓解了肝细胞脂肪变性，其机制可能与上调了Sirt1/AMPK基因表达有关。

小编有话说：

现有文献中，技术人员普遍采用棕榈酸钠联合油酸钠的技术方案诱导HepG2细胞脂肪堆积。而本文采用250μM棕榈酸（PA）、24 h处理HepG2细胞模拟高脂环境，体外实验表明棕榈酸能够促进HepG2细胞内脂肪蓄积并损害肝细胞功能，本研究为非酒精性脂肪性肝病中细胞脂肪蓄积和脂肪变性提供了良好的细胞模型，具有参考价值。

参考文献

路瑶，焦谊，古丽阿依木. 利拉鲁肽通过Sirt1/AMPK信号通路改善肝细胞脂肪变性机制研究[J]，实用肝脏病杂，2024(9).