IF/8.2:棕榈酸钠诱导心肌细胞损伤以建立糖尿病心肌病细胞模型

IF/8.2:棕榈酸钠诱导心肌细胞损伤以建立糖尿病心肌病细胞模型

International Journal of Biological Sciences

1. 前言

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病的重要并发症，以心肌代谢紊乱、线粒体功能障碍和慢性炎症为特征，其核心机制涉及线粒体质量控制失调、慢性炎症激活及巨噬细胞-心肌细胞交互作用。巨噬细胞作为先天免疫的关键效应细胞，通过分泌炎症因子（如S100A9）参与心肌纤维化、氧化应激和线粒体功能障碍。S100A9是钙结合蛋白家族成员，以异源二聚体（S100A8/A9）形式作为损伤相关分子模式（DAMP）发挥作用，在糖尿病心脏中显著上调，但此前其与DCM的直接关联尚未明确。S100A9作为损伤相关分子模式（DAMP），在心血管疾病中促进炎症反应，本文首次揭示巨噬细胞来源的S100A9通过激活STAT3信号通路，扰乱心肌细胞线粒体质量控制（包括过度分裂和线粒体自噬抑制），从而驱动DCM进展。

本研究通过单细胞测序筛选糖尿病心脏中S100A9的上调，建立两种糖尿病小鼠模型（STZ/HFD和db/db），利用巨噬细胞特异性敲除（S100a9flox/floxLyz2-Cre）、药理学阻断剂（Paquinimod）及心脏过表达病毒（AAV9-cTNT-S100a9），结合多组学分析揭示S100A9通过STAT3通路扰乱线粒体质量控制（线粒体分裂、自噬及氧化应激）的机制。此外，研究发现高脂环境（如棕榈酸、油酸）可改变细胞膜流动性及线粒体功能，加重心肌细胞炎症和代谢紊乱，为DCM研究提供了病理模型基础。

2.高脂细胞添加剂（Palmitic acid）

文中采用棕榈酸（钠）（PA）作为高脂细胞添加剂（货号KC006，Kunchuang Biotechnology）作为游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）处理细胞。棕榈酸（钠）（PA）作为脂毒性诱导剂，在细胞实验中用于模拟糖尿病高脂环境（浓度200μM，处理24小时）。

高脂细胞添加剂（KC006）中包括了棕榈酸（钠）、油酸（钠）和溶剂对照，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，浓度准确，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。从机制上讲，棕榈酸（钠）主要用于诱导细胞损伤和炎症反应，而油酸（钠）主要用于诱导细胞代谢紊乱。棕榈酸（钠）和油酸（钠）可以独立使用，也可以联合使用以便更好的模拟人体病理生理环境。

3.细胞处理及部分实验结果

1）S100A9的细胞来源与诱导机制

• 心肌细胞与巨噬细胞共表达：单细胞转录组（GSE213337）显示，糖尿病心脏中心肌细胞（α-actinin⁺）和髓系细胞（CD11b⁺）的S100A9表达显著升高（图1e-g）。免疫荧光证实S100A9与α-actinin或CD11b共定位（图1i）。
• 代谢应激诱导：高糖、棕榈酸（PA）、AGE等显著上调AC16和原代心肌细胞（NRVMs）S100A9蛋白（图1 j）。在心肌细胞（AC16、NRVMs）中，棕榈酸钠作为游离脂肪酸，模拟糖尿病脂毒性环境，诱导效率高于高糖。
• 巨噬细胞主导分泌：THP-1巨噬细胞在基础和高糖刺激下S100A9分泌量显著高于心肌细胞（图1c）。共培养实验表明，巨噬细胞S100A9敲减后，心肌细胞S100A9表达同步降低（图1d-f），证实巨噬细胞是S100A9的主要旁分泌来源。
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• 图1.S100A9在糖尿病心脏中表达上调。a-b，GEO数据库中糖尿病心脏多个RNA-seq数据集图、Venn图和火山图。c、糖尿病心肌组织差异表达基因（DEGs）mRNA表达（n=5）。d，糖尿病心肌组织中S100A9蛋白表达（n=5），微管蛋白用作加载对照。e.tSNE曲线单细胞RNA测序数据集（GSE213337）。f.细胞特异性标志物的点图。g，不同细胞类型中DEG的火山图。h.糖尿病小鼠（n=3）的原代心肌细胞和巨噬细胞（BMDM）中的S100A9蛋白表达。i，糖尿病小鼠心脏组织S100A9（绿色）、α-辅肌动蛋白（红色）或CD11b（红色）的免疫荧光染色。（比例尺=50μm，或ZOOM图片中的10μm）。j，由多种诱导因子诱导的心肌细胞（AC16细胞，NRVM）中S100A9蛋白表达。k，糖尿病小鼠BMDM培养上清中S100A9的浓度（n=5）。l，糖尿病小鼠条件BMDM上清液培养的AC16和NRVM中S100A9蛋白表达。
• 2）S100A9-STAT3信号轴激活线粒体分裂
  • STAT3磷酸化：rhS100A9（2μg/mL）或S100A9过表达均激活STAT3（Tyr705磷酸化），促进其核转位（图2 g-j）。
  • 非经典通路：即使敲低IL-6/JAK2通路基因，rhS100A9仍部分激活STAT3，提示其他机制（图2k-l）。
  • STIP1-STAT3互作：IP-MS发现S100A9促进STIP1与STAT3结合；TPR结构域缺失突变体（Δ259-427）削弱互作。

图2.S100A9激活心肌细胞中的STAT3。a，在暴露于rhS100A9（2μg/mL，24小时）的AC16心肌细胞中进行DIA-蛋白质组学。B、蛋白质组PCA图。c、蛋白质组GSVA分析。d，rhS100A9（2μg/mL，24小时）作用于AC16心肌细胞中TF启动子结合平板阵列的工作流程。e，rhS100A9诱导AC16心肌细胞中转录因子（TF）激活的柱状图。f、rhS100A9或S100A9过表达诱导的AC16心肌细胞STAT3mRNA的表达。rhS100A9浓度梯度（0、0.5、1、2、4、6μg/mL）作用于AC16细胞24h。显示S100A9、STAT3和STAT3磷酸化（Tyr705）水平的代表性印迹。微管蛋白用作加载对照。将pcDNA3.1（+）-Flag-S100A9质粒（0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5μgDNA）或空载体质粒转染AC16细胞48h，观察细胞凋亡情况。显示S100A9、STAT3和pSTAT3（Tyr705）水平的代表性印迹。微管蛋白用作加载对照。i，pSTAT3（Tyr705）在AC16细胞中的免疫荧光（比例尺=20μm）。j，分离了rhS100A9暴露或S100A9过表达的AC16细胞的核组分。Western印迹检测到pSTAT3（Tyr705）。层粘连蛋白B和微管蛋白分别用作细胞核和细胞质标记。k、IL6、IL6R、IL6ST、JAK2和STAT3mRNA水平在siRNA转染后的AC16细胞中。l，显示在siRNA转染和/或rhS100A9孵育的AC16心肌细胞中IL6、IL6R、IL6ST、JAK2、STAT3和pSTAT3（Tyr705）水平的代表性印迹。微管蛋白用作加载对照。所有数据均以平均值±SD表示。通过非配对studentt检验确定统计学显著性

• 3）线粒体功能障碍的表型验证

  • 线粒体分裂增强：rhS100A9或高糖处理导致心肌细胞线粒体碎片化（MitoTracker染色），上调DRP1（Ser616磷酸化）、FIS1和MFF。
  • 线粒体自噬抑制：mt-Keima检测显示rhS100A9降低自噬溶酶体（红点）比例及550nm/440nm荧光强度比。
  • 功能损伤：JC-1检测显示线粒体膜电位下降，MitoSOX指示氧化应激增强。

• 4）干预策略的细胞水平验证

  • Paquinimod（S100A9抑制剂）：逆转rhS100A9诱导的STAT3磷酸化、线粒体分裂及自噬抑制。
  • STAT3突变体（Y705F）：阻断S100A9对MFF/FIS1启动子的激活。

4.总结

巨噬细胞-心肌细胞相互作用作为糖尿病心肌病（DCM）潜在的干预靶点仍有待深入研究。单细胞分析发现，糖尿病心肌细胞和巨噬细胞中S100 A9作为一种免疫炎症介质表达上调。此外，糖尿病小鼠外周血和心脏中F4/80+ CCR 2 + S100 A9+巨噬细胞均增加。通过帕喹莫德或巨噬细胞耗竭（氯膦酸盐）阻断S100 A9减轻了糖尿病诱导的心功能障碍、炎性巨噬细胞浸润、血清促炎细胞因子。更重要的是，糖尿病性心功能不全、心肌重塑和炎症可以通过巨噬细胞特异性S100 A9敲除（S100 a9 flox/S100 Lyz 2-Cre）来抑制。S100 A9激活导致线粒体过度分裂，线粒体自噬通量降低，线粒体氧化应激升高。此外，蛋白质组学和转录因子谱阵列揭示了S100 A9在心肌细胞中激活STAT 3。然而，这些作用被STAT 3（Y 705 F）突变、STAT 3敲低或帕喹莫德减轻。研究强调了巨噬细胞来源的S100 A9作为糖尿病心功能障碍中线粒体质量控制受损的关键介质，靶向S100 A9代表了一个有前途的治疗靶点。

小编有话说：

棕榈酸（PA,KC006,Kunchuang Biotech）作为关键代谢应激源，联合高糖、AGE等诱导心肌细胞S100A9表达。细胞实验采用AC16、NRVMs及THP-1巨噬细胞，通过Westernblot、免疫荧光、mt-Keima线粒体自噬检测等技术，证实PA协同高糖加剧线粒体碎片化和氧化应激。棕榈酸（PA）作为高脂细胞模型的核心诱导剂，可高效模拟糖尿病心肌病的代谢应激损伤。本研究采用的浓度精准的高脂细胞添加剂（KC006），为疾病机制研究提供可靠工具。未来靶向S100A9-STAT3通路的药物开发（如Paquinimod类似物）有望成为糖尿病心肌病的新策略，而可靠的游离脂肪酸添加剂将是此类研究的基石试剂。

参考文献

Macrophage-derived S100A9 promotes diabetic cardiomyopathy by disturbing mitochondrial quality control via STAT3 activation. International Journal of Biological Sciences.2025.