原代肝细胞体外脂肪变性诱导方法（IF/6.1）

原代肝细胞体外脂肪变性诱导方法（IF/6.1）

Cell Death Discovery

1. 前言

脂肪肝（肝脂肪变性）显著增加肝移植中缺血再灌注损伤（IRI）的风险，导致移植物功能障碍。铁死亡（一种铁依赖的脂质过氧化驱动的新型细胞死亡方式）是脂肪肝IRI的关键机制，其核心调控因子GPX4的失活会加剧损伤。胰岛素诱导基因2（Insig2）作为内质网蛋白，参与脂质代谢与氧化应激平衡，但其在脂肪肝IRI中的作用尚未明确。本研究旨在探索Insig2是否通过调控GPX4依赖性铁死亡减轻脂肪肝IRI。

本研究采用如下技术路线：通过构建饮食诱导脂肪肝小鼠模型，结合Insig2基因敲除（KO）或肝细胞特异性过表达（OE），进行体内IRI实验；利用多组学分析机制，并通过铁死亡抑制剂（Fer-1）和激动剂（RSL3）验证Insig2-GPX4轴的作用。

细胞实验内容中，分离的原代肝细胞经油酸（钠）/棕榈酸（钠）处理诱导脂肪变性，以模拟体内病理环境。通过缺氧/复氧（H/R）模拟IRI，检测Insig2敲低或过表达对炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）、凋亡蛋白（Bax/Bcl-2、Cleaved-caspase3）及铁死亡标志物（PTGS2、ALOX12）的影响。药理学干预（Fer-1、RSL3）进一步验证Insig2-GPX4通路的功能。

2. 高脂细胞添加剂

文中采用油酸（钠）/棕榈酸（钠）作为高脂细胞添加剂（货号KC006，Kunchuang Biotechnology, Xian, China）处理细胞48小时。

该试剂盒包括了独立包装的油酸（钠）、棕榈酸（钠）和溶剂对照，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，无需多次加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。其中，棕榈酸（钠）主要诱导细胞损伤和炎症反应，而油酸（钠）主要促进细胞脂质沉积，诱导细胞代谢异常。因此，在研究非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）时，更推荐采用0.25mM棕榈酸（钠）与0.5mM油酸（钠）联合诱导的技术方案，不仅能更好地模拟人体内的病理生理环境，还能提高实验结果的可靠性。

3.细胞处理及部分实验结果

本研究通过原代肝细胞实验深入解析Insig2在脂肪肝IRI中的保护机制。从小鼠分离的原代肝细胞经500μM油酸（钠）和250μM棕榈酸（钠）（Kunchuang Biotechnology）孵育48小时，成功诱导脂质蓄积，模拟临床脂肪肝病理状态（Oil Red O染色验证，图1B）。

图1  肝Insig2过表达改善脂肪肝中的肝I/R损伤

1）Insig2基因干预与H/R损伤：

Insig2敲低加剧损伤如图2A-C所示，经AAV8-shRNA转染敲低Insig2后，H/R刺激（6小时缺氧+6小时复氧）显著升高炎症因子mRNA（IL-6、IL-1β、TNF-α）（图2B），并上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3，同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2（图2C）。

图2  Insig2显示了H/R期间原代肝细胞的炎症和凋亡

细胞死亡表型与铁死亡相关：伴随铁死亡标志基因PTGS2/ALOX12表达增加（图3A）、肝脏和血清中铁含量增加（图3B-C）、脂质过氧化产物MDA升高（图3E）等。

图3  Insig2缺陷促进脂肪变性肝脏中I/R诱导的铁蛋白下垂

Insig2过表达减轻损伤如图2D-F所示，Insig2 OE肝细胞经H/R后，炎症因子释放减少（图2E），凋亡蛋白表达改善（Bax↓、Bcl-2↑）（图2F），证实Insig2直接抑制炎症与凋亡。

2）药理学验证铁死亡机制：

Fer-1挽救Insig2 KO损伤，铁死亡抑制剂Fer-1预处理显著降低Insig2 KO肝细胞的ALT/AST、炎症因子及TUNEL阳性细胞率，逆转因Insig2缺失导致的铁死亡加剧。

RSL3拮抗Insig2 OE保护作用，GPX4抑制剂RSL3处理取消Insig2过表达的保护效应，重新激活铁死亡（PTGS2/ALOX12↑）、炎症及细胞凋亡，明确Insig2通过GPX4依赖途径抑制铁死亡。

3）多组学关联分析：

转录组/蛋白质组显示Insig2 KO扰乱脂代谢通路（KEGG富集），代谢组检测到花生四烯酸氧化产物12-HETE/15-HETE显著积累，直接证实Insig2缺失促进脂质过氧化，驱动铁死亡。

4.总结

肝脂肪变性显著增加了肝移植术后缺血-再灌注损伤的易感性。本研究旨在探讨胰岛素诱导基因2（Insig2）在脂肪肝I/R损伤中的保护作用及其机制。采用Insig2敲除或肝细胞特异性过表达的小鼠模型和高脂饮食诱导脂肪变性，对这些小鼠进行肝脏I/R损伤。从脂肪肝中分离原代肝细胞，用于体外缺氧复氧（H/R）实验。体内和体外综合研究发现，Insig2缺乏加重了肝脏I/R损伤后脂肪肝的损伤，而其过度表达提供了保护作用。转录组、蛋白质组和代谢组的综合分析发现，Insig2缺陷可扰乱脂质代谢和氧化应激稳态，尤其是抑制GPX4表达，诱导铁细胞凋亡。此外，对铁细胞凋亡的化学抑制逆转了Insig2缺陷的有害作用；而Insig2过表达的保护作用被GPX4的靶向抑制所抵消，导致肝脏I/R损伤加重。这些见解强调了Insig2-GPX4轴作为治疗靶点的潜力，为增强脂肪变性肝移植物对I/R损伤的恢复力提供了一种新途径。

小编有话说：

油酸（钠）和棕榈酸（钠）作为高脂添加剂，在体外成功诱导原代肝细胞脂肪变性，为模拟脂肪肝IRI提供了可靠模型。文中采用500 μM油酸（钠）联合250 μM棕榈酸（钠）处理48小时可稳定复制肝细胞脂滴蓄积，且H/R损伤后铁死亡标志物（MDA、PTGS2）显著升高，证实该模型适用于机制研究。

可靠、稳定的高脂细胞添加剂能够精准模拟病理脂质微环境，为脂肪肝机制研究提供关键工具。未来可进一步探索Insig2-GPX4轴靶向药物联合高脂细胞模型，开发新型肝保护剂，提升脂肪肝供肝利用率。该试剂的高稳定性和可重复性将助力铁死亡及相关代谢疾病的创新药物研发。

参考文献

Insulin-induced gene 2 alleviates ischemia-reperfusion injury in steatotic liver by inhibiting GPX4-dependent ferroptosis [J], Cell Death Discovery, 2025.