IF/7.5：高糖高脂刺激H9c2心肌细胞模拟DCM（糖尿病心肌病）微环境

1. 前言

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病的主要并发症，以心脏结构异常、代谢紊乱和心功能进行性下降为特征，其核心机制涉及线粒体功能障碍与炎症反应激活。近年研究发现，cGAS-STING通路通过感知胞质DNA（如线粒体DNA泄漏）触发炎症级联反应，进而激活NLRP3炎性体及下游焦亡蛋白GSDMD，导致心肌细胞焦亡——一种伴随膜破裂和IL-1β释放的程序性死亡形式，直接加剧DCM的心肌纤维化与重构。鸢尾素（Irisin）作为运动诱导的肌源性因子，可通过上调线粒体泛素连接酶MITOL改善线粒体稳态，但其是否通过调控cGAS-STING-GSDMD轴抑制焦亡来缓解DCM尚不明确。

研究结合高脂饮食/链脲佐菌素诱导的DCM小鼠模型及棕榈酸/高糖（HG/HF）处理的H9c2细胞模型，通过干预鸢尾素、MITOL过表达腺病毒、STING抑制剂（C-176）及激活剂（diABZI），系统评估心脏功能、焦亡标志物及MITOL/STING通路活性。

H9c2心肌细胞暴露于HG/HF（25mM葡萄糖+300μM棕榈酸）模拟DCM微环境，通过JC-1检测线粒体膜电位、PI/Hoechst染色量化焦亡率、Westernblot分析MITOL/STING/GSDMD-N蛋白表达，并分别采用siRNA敲低MITOL、药物调控STING活性，验证鸢尾素通过MITOL抑制STING依赖性焦亡的机制。

2. 高脂细胞添加剂

文中采用棕榈酸钠作为高脂细胞添加剂（现货号KC001，原货号SYSJ001，Kunchuang Biotechnology）处理细胞。同时采用葡萄糖作为高糖细胞添加剂配合棕榈酸钠，模拟高糖高脂的糖尿病心肌病微环境。

该试剂（KC001）包括了5ml、6mmol/L无菌包装的棕榈酸钠和5ml的溶剂对照，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。其中，棕榈酸（钠）主要诱导细胞损伤和炎症反应。此外，还可以直接使用即用型高糖高脂试剂盒（货号KT001），包含独立包装的葡萄糖、甘露醇、棕榈酸钠以及高脂溶剂对照，提升实验效率。

3.细胞处理及部分实验结果

1）HG/HF诱导心肌细胞焦亡及鸢尾素的保护作用

在棕榈酸钠/高糖刺激下，H9c2细胞呈现典型焦亡特征：PI阳性细胞率显著升高（图1c-d，红色荧光标记焦亡核，DAPI标记总核），同时线粒体膜电位（JC-1聚合体/单体比值）下降，表明线粒体损伤驱动细胞死亡。Westernblot结果（图1a-b）显示HG/HF组GSDMD-N片段、cGAS、STING、NLRP3及IL-1β蛋白表达均上调，证实cGAS-STING通路激活及焦亡执行。而鸢尾素预处理可显著逆转上述现象：PI阳性率降低约40%，JC-1比值恢复，且GSDMD-N和STING蛋白水平下降（图1d,4d），说明鸢尾素通过维持线粒体功能抑制焦亡。

图1  鸢尾素对HG/HF处理中H9c2细胞的影响

2）MITOL的核心调控地位

鸢尾素对HG/HF损伤的保护作用依赖MITOL表达。如图2a-b所示，鸢尾素处理使MITOL蛋白水平提升2.1倍，但敲低MITOL（siRNA）后，其抗焦亡效应被完全消除：JC-1聚合体/单体比值再度下降（图2c-d，绿色单体荧光增强），PI阳性细胞率反弹至HG/HF水平（图2e-f），且STING和GSDMD-N蛋白表达回升。这表明MITOL是鸢尾素下游的关键效应分子，通过负调控STING通路抑制焦亡。

图2  MITOL抑制HG/HF联合或不联合Irisin处理对H9c2细胞的影响

3）STING通路的双向调控验证

为明确STING在MITOL下游的作用，研究使用STING激活剂diABZI处理鸢尾素保护的H9c2细胞。如图3所示，diABZI可抵消鸢尾素对线粒体的保护（JC-1比值回落，图3c-d）并逆转焦亡抑制（PI阳性率升高，图3e-f），且Westernblot中STING和GSDMD-N蛋白再度升高（图3a-b），但MITOL表达不变，证实STING是MITOL下游的独立作用靶点。反之，在MITOL敲低细胞中施加STING抑制剂C176，可部分恢复线粒体膜电位（JC-1聚合体增加）并减少PI阳性细胞，说明抑制STING能挽救MITOL缺失导致的细胞损伤。

图3  diABZI对HG/HF联合或不联合Irisin处理的H9c2细胞的影响

4）细胞实验与动物模型的一致性

细胞层面结论与小鼠心脏组织结果相互印证：DCM心肌中STING和GSDMD-N蛋白高表达，鸢尾素或Ad-MITOL干预后显著降低；而STING抑制剂C176虽不影响MITOL表达，但同样抑制焦亡并改善心功能，进一步支持"MITOL→STING→GSDMD焦亡轴"的普适性机制。

4.总结

糖尿病性心肌病（DCM）是糖尿病（DM）的常见并发症。然而，DCM诱导心脏损伤的潜在机制仍不清楚.近年来，环化GMP-AMP合酶/干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）信号通路与肥厚在DCM发病中的作用已有研究。基于我们先前的研究结果，本研究旨在研究马蔺子素、线粒体泛素连接酶（MITOL/MARCH 5）和cGAS/STING信号通路在DCM诱导的心功能不全中的作用以及gasdermin D（GSDMD）依赖性眼球下垂的作用。在实验结束时，使用高脂饮食诱导的小鼠和H9c2细胞进行心脏几何形状和功能或与心脏病相关的生物标志物评估。在此，我们发现DCM通过增加心脏纤维化和GSDMD依赖性睑下垂损害心脏功能，包括激活MITOL和cGAS/STING信号传导。我们的结果证实马蔺素和MITOL的保护作用被cGAS/STING信号通路的激活部分抵消。我们还证实了GSDMD依赖性睑下垂在DCM发病的病理过程中起着关键作用。我们的结果表明，鸢尾素治疗通过上调MITOL来保护DCM损伤、线粒体稳态和血小板减少。

小编有话说：

棕榈酸钠（300μM）作为高脂刺激的核心试剂能够成功模拟DCM的脂毒性微环境，诱导线粒体膜电位崩溃（JC-1绿/红比↑）及GSDMD依赖性焦亡（PI+细胞率↑~3倍），且同步激活cGAS-STING通路（STING蛋白↑1.8倍）。

该模型高度依赖棕榈酸的批次稳定性与溶解度，高脂细胞添加剂（KC001）提供的钠盐制剂经严格质控，脂质纯度高（>99%）、低内毒素（<0.1EU/mg），确保实验可重复性。其应用覆盖心肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞等多种代谢疾病模型，可精准模拟脂质堆积引发的线粒体损伤-炎症级联反应。未来研究可进一步结合该试剂探索脂毒性心肌病的药物靶点，推动DCM干预策略的临床转化。

参考文献

Irisin improves diabetic cardiomyopathy-induced cardiac remodeling by regulating GSDMD-mediated pyroptosis through MITOL/STING signaling [J], Biomedicine & Pharmacotherapy.