建立HepG2细胞脂质沉积模型以模拟高脂环境下的代谢失衡（中科院1区）

建立HepG2细胞脂质沉积模型以模拟高脂环境下的代谢失衡（中科院1区）

Food Science and Human Wellness

1. 前言

在全球肥胖及相关代谢疾病发病率持续攀升的背景下，天然产物因其低毒性及多靶点作用成为抗肥胖研究热点。陈皮作为传统药食同源材料，富含黄酮类、多甲氧基黄酮等活性成分，已有研究证实其提取物可通过调控AMPK、PI3K/Akt等信号通路改善脂质代谢。然而，其核心活性成分及分子机制尚未完全阐明。网络药理学作为整合多组学数据与人工智能的新兴方法，可系统解析“成分-靶点-通路”多维关系，为天然产物的作用机制研究提供高效工具。结合分子对接技术可预测活性成分与靶点的结合效能，而体外脂质累积细胞模型（如HepG2细胞）则成为验证网络预测结果的关键实验平台。

本研究基于TCMSP数据库筛选陈皮活性成分，通过Swiss Target Prediction和SEA数据库预测靶点，与肥胖相关基因取交集后构建PPI网络，结合分子对接筛选核心成分，并通过FFA诱导的HepG2细胞模型验证其抗脂质沉积效应及PI3K/Akt/GSK3β通路调控机制。

本研究采用油酸与棕榈酸（2:1）混合FFA诱导HepG2细胞脂质沉积模型，通过CCK-8评估陈皮活性成分（如川橘皮素）的细胞毒性，油红O染色和TG含量测定量化脂滴积累，qPCR及Western blot检测PI3K/Akt/GSK3β通路关键基因（如PI3K、Akt、GLUT4）及蛋白磷酸化水平变化，验证网络药理预测结果。

2.高脂细胞添加剂（FFA）

文中采用棕榈酸（钠）/油酸（钠）（oleate/palmitic acid）作为高脂细胞添加剂（货号KC006，Xian Kunchuang Science and Technology Develop Co., Ltd.）作为游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）处理细胞。

针对HepG2肝细胞，部分研究人员会单独使用棕榈酸（钠）或油酸（钠）进行诱导，由于肝细胞本身较为敏感，某些情况下单独使用其中一种脂肪酸也能获得理想的实验结果。然而，从机制上讲，棕榈酸（钠）主要诱导细胞损伤和炎症反应，而油酸（钠）主要促进细胞脂质沉积。因此，在研究非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）时，更推荐采用0.25mM棕榈酸（钠）与0.5mM油酸（钠）联合诱导的技术方案，不仅能更好地模拟人体内的病理生理环境，还能提高实验结果的可靠性和科学性。油酸高脂细胞添加剂（KC006）中包括了棕榈酸（钠）、油酸（钠）和溶剂对照，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，浓度准确，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

3.细胞处理及部分实验结果

在FFA诱导的HepG2细胞模型中，油酸与棕榈酸的协同作用显著升高细胞内TG含量（图1C），油红O染色显示脂滴大量聚集（图1B），模拟了高脂饮食下的肝脏脂质代谢紊乱。橘皮素（tangeretin）干预后，脂滴数量显著减少（图1B），TG水平剂量依赖性下降（图1C），表明其抑制脂质沉积的效能。分子对接结果显示，川橘皮素与PI3K/Akt通路核心靶点（如AKT1、GSK3β）具有高亲和力（结合能≤-7.0 kcal/mol），其疏水相互作用及氢键网络稳定了靶点结合，提示其可能直接调控该通路。

图1（A）橘皮素对HepG2细胞的细胞存活力的影响。与对照组相比，在*p < 0.05和*p < 0.0001时具有统计学显著性。(B)橘皮素对HepG2细胞脂质积聚的抑制作用。(C)橘皮素对HepG2细胞TG含量的影响。(D) 橘皮素处理的HepG2细胞中脂质蓄积基因的mRNA水平，包括FABP1、PLIN2、FAS和GLUR4。(E)柑橘素对PI3K/Akt/GSK3β信号通路mRNA水平的影响所有结果均以平均值 ± SD表示，实验重复三次。方差分析和Tukey多重检验结果显示，不同字母（a-e）的条形图之间存在显著性差异（p < 0.05）。

qPCR分析表明，橘皮素显著上调PI3K、Akt及GLUT4的mRNA表达（图2A-C），同时抑制脂质合成相关基因FAS和PLIN2的表达，证实其通过促进葡萄糖转运与脂解、抑制脂质合成实现代谢调控。Western blot进一步显示，橘皮素可增强PI3K（Tyr458）和Akt（Ser473）的磷酸化水平，并激活下游GSK3β（Ser9）的磷酸化，从而抑制GSK3β 活性，促进糖原合成并减少脂质积累。这些结果与网络药理预测的PI3K/Akt通路核心地位高度一致，且橘皮素的ADMET特性（低毒性、高生物利用度）支持其作为功能性食品开发的潜力。

图2 (A) 25μmol/L橘皮素对CFA诱导的HepG2细胞中PI3K/Akt/GSK3β信号通路相关蛋白的影响。(B) PI3K/Akt/GSK3β信号通路相关磷酸化蛋白。（C）p-PI3K/PI3K;（D）p-Akt/Akt;（E）p-GSK3β/GSK3β的相对蛋白水平。所有结果均表示为平均值±SD，实验重复三次。根据方差分析和Tukey多重检验，不同字母的条形图之间存在显著性差异（p < 0.05）。

此外，FFA模型还揭示了AMPK信号通路的潜在参与，提示陈皮可能通过多通路协同发挥抗肥胖作用。然而，本实验聚焦于PI3K/Akt轴的验证，后续研究可拓展至AMPK与NF-κB通路的交叉调控机制。

4.总结

本研究揭示了陈皮抗肥胖的活性植物化学成分及其分子机制，原文中共鉴定出17种活性化合物、189个抗肥胖核心靶标和8个中心靶标。KEGG信号通路分析表明，陈皮抗肥胖的分子机制可能涉及PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、AMPK信号通路和NF-κB信号通路。研究结果也支持了陈皮的减肥作用可能是多靶点、多信号通路的直接或间接协同作用的结论。分子对接结果表明，陈皮活性成分可与中枢靶点（AKT1、BCL2、CASP3、EGFR、JUN、SRC、TP53和TNF）结合。基于ADMET分析和网络药理学结果，橘皮素显示出最低的预测毒性和抗肥胖作用的潜力。在体外脂质蓄积模型中，橘皮素能够下调FABP1、FAS、PLIN2和GLUT4的基因表达。此外，红桔还可通过增加PI3K、Akt和GSK3β的mRNA和蛋白磷酸化水平，激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路，从而减少细胞内脂肪蓄积，发挥减肥作用。综上所述，橘皮素可能通过调节PI3K/Akt/GSK3β信号通路抑制FFA诱导的HepG2细胞脂质蓄积。

小编有话说：

本研究采用油酸与棕榈酸（2:1）混合FFA成功构建HepG2细胞脂质累积模型，模拟了高脂环境下的代谢失衡。材料方法部分详细列出试剂来源及实验条件（750 μmol/L FFA孵育24小时），确保结果可重复性。油红O染色、TG定量及分子检测技术系统验证了橘皮素的脂代谢调控作用，为陈皮功能性产品开发提供理论依据。油酸/棕榈酸试剂盒（KC006）作为高脂细胞模型的关键添加剂，以其高纯度与稳定性，为脂代谢研究提供可靠工具，助力天然产物抗肥胖机制探索及产品转化。本研究结果可为进一步研究陈皮中的抗肥胖植物化学成分及其作用机制提供线索，并为开发基于陈皮及其植物化学成分的现代功能性食品或抗肥胖药物奠定基础。

参考文献

Luo, J., Yan, W., Chen, Z., & Xu, B. (2025). Elucidating the anti-obesity phytochemicals in Chenpi and their molecular mechanisms. Food Science and Human Wellness. Advanced Online Publication. https://doi.org/10.26599/FSHW.2024.9250204