Biofabrication（IF/8）：高糖高脂（HGPA）模拟糖尿病炎症环境处理巨噬细胞（THP-1）和成骨细胞（MC3T3-E1）以构建细胞炎症模型

Biofabrication（IF/8）：高糖高脂（HGPA）模拟糖尿病炎症环境处理巨噬细胞（THP-1）和成骨细胞（MC3T3-E1）以构建细胞炎症模型

1. 前言

糖尿病牙周炎（DP）作为糖尿病的第六大并发症，其骨愈合困难主要归因于高血糖诱导的活性氧（ROS）过度生成和酸性微环境，这些条件加剧巨噬细胞功能障碍、炎症反应及氧化应激，进而抑制成骨细胞活性。研究发现，在糖尿病牙周炎中，巨噬细胞中ANXA1表达下调，激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路，促进细胞焦亡，进一步阻碍骨修复。为此，本研究构建了一种智能响应型GPPG水凝胶，旨在靶向调控巨噬细胞焦亡并促进成骨。

本研究技术路线围绕构建一种ROS/pH双响应型GPPG水凝胶，负载ANXA1活性肽Ac2-26与成骨肽OGP，通过体外细胞实验与糖尿病大鼠牙周炎模型，系统验证其对巨噬细胞焦亡的抑制及骨再生的促进作用。

细胞实验部分以THP-1源性巨噬细胞及MC3T3-E1成骨细胞为对象，模拟糖尿病炎症环境（高糖+棕榈酸钠，HGPA），评估水凝胶对细胞焦亡、ROS水平及成骨分化能力的影响。实验涵盖细胞活性、焦亡相关蛋白表达、成骨基因与蛋白检测等多维度分析，全面揭示Ac2-26与OGP在调控炎症与成骨微环境中的协同作用。

2. 高脂细胞添加剂

文中采用棕榈酸钠作为高脂细胞添加剂（货号KC001，Kunchuang Biotechnology）处理巨噬细胞与成骨细胞，模拟糖尿病代谢应激环境

该试剂（KC001）包括了独立包装的6mmol/L棕榈酸钠和溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。其中，棕榈酸钠可以用来诱导细胞损伤和炎症。

此外，也可以直接使用高糖高脂试剂盒（KT001），该试剂盒包括了独立包装的10mmol/L的棕榈酸钠、1mol/L的葡萄糖、1mol/L的甘露醇以及高脂对照，适用于所有类型的细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

3.细胞处理及部分实验结果

在具体细胞实验中，研究团队通过免疫荧光与Western blot等手段深入探究了巨噬细胞在糖尿病炎症状态下的变化。如图1所示，糖尿病牙周炎组织中巨噬细胞标志物CD68与ANXA1共定位减少，而与焦亡执行蛋白GSDMD共定位增强，提示ANXA1下调与焦亡激活密切相关。扫描电镜图像进一步显示，HGPA处理后的巨噬细胞出现膜孔洞与形态肿胀，典型焦亡特征明显。通过siRNA干扰NLRP3表达及使用Disulfiram抑制剂，证实该焦亡过程依赖于NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路。

图1  糖尿病牙周炎患者ANXA1降低伴巨噬细胞下垂

图1中扫描电镜（SEM）清晰展现对照组巨噬细胞形态完整，而HGPA（25.5mM葡萄糖+200μM棕榈酸）处理组细胞膜出现明显孔洞和balloon样突起，符合焦亡典型形态。Western blot结果进一步量化机制：HGPA组NLRP3表达提升2.1倍，Cleaved Caspase-1及GSDMD-NT片段（焦亡执行蛋白）分别增加1.8倍和2.3倍，同时Cleaved IL-1β升高，证实炎症小体激活及焦亡级联反应。

在成骨方面，如图2所示，HGPA环境下成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）活性及矿化结节形成显著减弱，成骨关键基因（RUNX2、OCN等）表达下调，显示糖尿病炎症严重损害成骨功能。

图2  在与糖尿病相关的炎症条件下成骨活性降低

随后，蛋白免疫印迹显示Ac2-26干预使HGPA环境下的NLRP3、GSDMD-NT表达回落至近正常水平，且ANXA1过表达实验可复现该效应。机制上，DCFH-DA荧光检测表明，HGPA组ROS荧光强度较对照组增强3.5倍，而Ac2-26处理组降低67%，提示其通过抗氧化途径调控焦亡。基因沉默实验（siNLRP3）后，即使给予HGPA刺激，焦亡标志物亦无显著上升，明确NLRP3为Ac2-26的核心靶点。

进一步将细胞与水凝胶共培养后发现，负载Ac2-26的GPPG水凝胶显著恢复巨噬细胞膜完整性，降低NLRP3、GSDMD-NT、Cleaved Caspase-1等焦亡蛋白表达，并有效抑制ROS积聚；而OGP的引入则明显增强成骨细胞ALP活性、矿化能力及成骨标志物表达，如图所示，双肽共载组在抑制焦亡与促进成骨方面均表现最优，体现协同修复效应。

图3OGP-GPPG水凝胶促进成骨细胞体外成骨分化

图中，成骨细胞实验表明，HGPA显著抑制成骨分化：qPCR显示RUNX2、OCN、ALP基因表达下降40-60%，ALP染色活性削弱。而OGP/GPPG组ALP阳性面积增加2.2倍，钙结节定量（CPC溶解法）提升1.9倍。Western blot中OPN、OSX蛋白在OGP组表达恢复，证实其通过激活BMP2等通路挽救成骨功能。

4.总结

糖尿病背景的牙周炎患者由于血糖水平升高，导致活性氧(ROS)产生过多和低pH环境，颅面骨缺损的愈合一直是困难的。这些情况对巨噬细胞的功能产生负面影响，加重炎症和氧化应激，最终阻碍成骨细胞的骨修复能力。本文首次发现在糖尿病牙周炎(DP)环境中，巨噬细胞中Annexin A1(ANXA1)的表达减少，激活了NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路，最终增加了巨噬细胞的焦亡。接下来，开发了一种新型的GPPG智能水凝胶系统，该系统具有ROS和pH响应性，并负载了ANXA1生物活性多肽Ac2-26和成骨多肽OGP。研究发现，Ac2-26/OGP/GPPG可通过ANXA1/NLRP3/Caspase-1/GSDMD途径有效降低ROS，减轻巨噬细胞焦亡，促进成骨分化。通过对糖尿病大鼠牙周炎牙缺失模型的动物实验，进一步验证了Ac2-26/OGP/GPPG对糖尿病大鼠牙周组织松弛和骨缺损修复的调节作用。

小编有话说：

棕榈酸（钠）作为长链饱和脂肪酸，是诱导糖尿病细胞模型的核心试剂。研究详细阐述了HGPA炎症模型的建立，本文采用200μM PA联合高糖（25.5mM）模拟DP微环境，通过CCK-8、Western blot、qPCR、ALP/ARS染色及免疫荧光等技术系统评估细胞反应。棕榈酸（钠）作为关键代谢应激诱导剂，有效激活NLRP3炎症小体并引发细胞焦亡，其在实验中的稳定表现保障了疾病模型的可重复性与可靠性。实验所用棕榈酸钠源自Kunchuang Biotechnology，其高纯度（≥99%）与水溶性保障了数据可重复性。

高脂细胞添加剂（货号KC001）以高批次稳定性、低内毒素特性、浓度准确、常温低温无析出等优点，成为糖尿病细胞模型构建的理想选择。本研究证实其可精准模拟体内脂毒性，为靶向ANXA1通路的新型疗法奠定基础。未来可进一步探索该试剂在代谢性疾病、炎症机制等研究的应用潜力，助力创新药物开发。

参考文献

Li, R., Li, W., Teng, Y., Li, R., Kong, S., Chen, X., Luo, H., Chen, D., Guo, Y. & Qing, Y. (2025). Ameliorating macrophage pyroptosis via ANXA1/NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway: Ac2-26/OGP-loaded intelligent hydrogel enhances bone healing in diabetic periodontitis. Biofabrication, 17(2), 025001. https://doi.org/10.1088/1758-5090/ada737