HepG2脂肪肝细胞模型建立方法

1. 研究背景

在当前肝病和代谢领域面临严峻挑战的背景下，MASLD（代谢功能障碍相关脂肪性肝病）因其高患病率和复杂的发病机制备受关注。中药以其整体调节、多靶点作用的特点，在MASLD治疗中展现出独特优势。特别是祛湿活血方（QSHXF）作为经验方，已在临床和基础研究中显示出改善脂代谢和炎症的潜力。AMPK/SREBP1c信号通路作为调节脂质合成与代谢的关键通路，成为研究中药干预MASLD机制的重要切入点。本文以此为技术背景，结合细胞实验方法，系统探究了祛湿活血方对游离脂肪酸诱导的HepG2细胞脂质沉积的作用及其分子机制。

2. 技术路线

本文的技术路线围绕体外细胞实验展开：首先通过CCK8法筛选祛湿活血方的适宜浓度，随后建立游离脂肪酸诱导的HepG2细胞脂肪肝模型，并设置不同浓度祛湿活血方干预组及AMPK抑制剂对照组。通过油红O染色、脂质荧光染色观察脂滴积累情况，结合GPO-PAP酶法、TBA法、羟胺法和ELISA等技术检测脂质水平、氧化应激及炎症因子变化，并进一步采用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色分析AMPK/SREBP1c通路相关基因及蛋白表达，从而全面评估祛湿活血方的干预效果。

在细胞实验方面，研究使用HepG2细胞系，给予250 μmol/L棕榈酸钠联合500 μmol/L油酸钠处理24小时，成功诱导脂肪肝细胞模型。通过给予不同浓度祛湿活血方含药血清及AMPK抑制剂Compound C进行干预，系统考察了祛湿活血方对细胞脂质沉积、炎症反应和氧化应激的影响，并深入探讨了AMPK/SREBP1c信号通路在其中的调控作用。

3. 高脂细胞添加剂

本文在体外细胞模型中，使用油酸钠、棕榈酸钠作为高脂细胞添加剂处理HepG2细胞，建立HepG2脂肪肝细胞模型以模拟MASLD病理状态，帮助分析肝细胞脂肪变性的病理变化。

该高脂细胞添加剂（货号KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的油酸钠、棕榈酸钠相比，具有如下显著优点：

1）该试剂为液体溶液，浓度准确，可以直接溶解在细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。

2）该试剂的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。

3）该试剂常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

需要说明的是，棕榈酸钠可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸钠可以用来诱导细胞代谢异常。棕榈酸钠和油酸钠可以单独使用，也可以联合使用，棕榈酸钠和油酸钠联合诱导更加符合人体环境，适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

实际使用时，棕榈酸钠和油酸钠可以采用如下比例，直接加入完全培养基。

油酸钠：母液浓度12 mM→作用浓度0.5 mM，稀释了24倍； 

棕榈酸钠：母液浓度6 mM→作用浓度0.25 mM，稀释了24倍； 

24份总体积=1份油酸钠+1份棕榈酸钠+22份完全培养基； 

此时，以1.2 mL为例，油酸钠加1.2/24=0.05 mL，棕榈酸钠加1.2/24=0.05 mL，其余为完全培养基。以1mL为例，油酸钠加1/24=0.0417 mL，棕榈酸钠加1.2/24=0.0417 mL，其余为完全培养基。

4. 细胞实验内容

4.1. 细胞模型建立及分组

采用250 μmol/L棕榈酸钠联合500 μmol/L油酸钠的FFA于37℃，5% CO₂培养箱培养24 h作为诱导脂肪肝细胞模型建立的条件。确定含药血清使用浓度：HepG2细胞分为6组，空白血清组（20%大鼠空白血清）和2.5%、5%、10%、15%、20%含药血清组。血清浓度不足20%，添加大鼠空白血清补至20%。通过CCK-8实验检测细胞活力。

4.2. 细胞的分组干预

根据CCK-8结果选择QSHXF的3个最适浓度继续后续研究。将实验分为正常对照组、模型组和祛湿活血方低、中、高剂量组。将HepG2细胞按15×10⁴个/孔接种于六孔板中，待细胞生长达60%左右，使用250 μmol/L棕榈酸钠联合500 μmol/L油酸钠的游离脂肪酸处理24 h，诱导建立脂肪肝细胞模型，并给予不同浓度祛湿活血方含药血清及AMPK抑制剂（Compound C）对HepG2细胞进行24 h干预。通过测定TC、TG含量结果确定最佳祛湿活血方血清干预浓度。后续实验分为5组：正常组（Control）、模型组（Model）、祛湿活血方治疗组（Model+QSHXF组）、模型加抑制剂组 （Model+Compound C组）、模型加祛湿活血方加抑制剂组（Model+QSHXF+Compound C组）。其中 Compound C浓度为10 μmol/L。Compound C是一种选择性的ATP竞争性AMPK抑制剂，在细胞实验中常被用于阻断AMPK相关信号通路。细胞在经过24h培养后，被连同培养液一起收集，以用于后续检测。

4.3. 油红O染色细胞内脂滴形成情况

细胞经油红O固定液固定后，使用60%异丙醇进行浸洗。按照试剂说明书配制油红O工作液并对细胞进行染色。随后以60%异丙醇进行漂洗，直至细胞间质背景清晰。采用Mayer苏木素染液对细胞核进行复染。油红O缓冲液孵育返蓝。最后于倒置显微镜下观察。

随后，采用固定液固定细胞，加入适量染色工作液，室温避光孵育。于荧光显微镜下观察。最后采用ImageJ 8.0软件进行分析。并采用刮刀刮下细胞，按试剂盒说明对细胞内的TC、TG、SOD、GSH及其相应的蛋白浓度进行测定。收集细胞上清液，按试剂盒说明对TNF-α、IL-1β进行测定。

4.4. 结果分析

在具体的细胞实验过程中，如图1所示，通过油红O染色可直观观察到模型组细胞内出现明显的红色脂滴积累，而祛湿活血方干预后脂滴显著减少，表明中药能有效抑制脂质沉积。脂质荧光染色结果进一步证实了这一发现，模型组细胞荧光强度明显增强，祛湿活血方干预后荧光强度显著降低。

图1 各组细胞油红O染色结果（×400）

如图2所示，在脂质含量检测方面，酶法结果显示模型组细胞中总胆固醇和甘油三酯水平显著升高，经祛湿活血方处理后两者含量均明显下降，其中高剂量组效果最为显著。

图2 各组细胞内TC、TG、TNF-α、IL-1β、MDA、SOD含量（n = 9）

炎症与氧化应激指标检测发现，模型组TNF-α、IL-1β和MDA含量显著增加，SOD活性降低，而祛湿活血方干预后这些异常指标均得到明显改善。在分子机制层面，qRT-PCR和Western blot结果显示，祛湿活血方能上调AMPK mRNA表达及p-AMPK/AMPK蛋白比值，同时下调SREBP1c、FASN、ACC1和SCD1的基因和蛋白表达。免疫荧光染色进一步显示，模型组细胞中FASN、ACC1和SCD1的荧光强度明显增强，祛湿活血方干预后荧光信号显著减弱，这些结果从多角度证实了祛湿活血方通过激活AMPK/SREBP1c通路抑制脂质合成的分子机制。

5. 总结

为探究祛湿活血方对游离脂肪酸（FFA）诱导的HepG2细胞的作用及机制，采用体外细胞实验，利用CCK-8法测定不同浓度祛湿活血方对HepG2细胞活性的影响以选定适宜浓度进行后续实验。随后使用250 μmol/L棕榈酸钠溶液联合500 μmol/L油酸钠的游离脂肪酸处理24h诱导建立脂肪肝细胞模型，并给予不同浓度祛湿活血方含药血清及AMPK抑制剂对HepG2细胞进行24h干预。通过油红O染色法和脂质荧光染色法观察细胞内脂滴积聚情况，采用GPO-PAP酶法检测细胞内总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量变化，TBA法检测和羟胺法分别检测丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量，ELISA检测肿瘤坏死因子－α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）的含量，进一步运用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色技术检测细胞内脂质代谢相关基因及蛋白的表达。结果显示，祛湿活血方可显著改善FFA诱导的HepG2细胞脂质沉积，氧化应激及炎症反应，显著降低细胞中TC、TG、MDA、TNF-α、IL-1β的含量和提高SOD活性（P<0.01），提高AMPK，降低SREBP1c、FASN、ACC1和SCD1的mRNA表达水平（P<0.05），以及增加p-AMPK/AMPK，降低SREBP1c、FASN、ACC1和SCD1的蛋白表达（P<0.05）。祛湿活血方能够显著改善MASLD细胞模型的脂质代谢，并减轻氧化应激及炎症反应，其机制可能与激活AMPK/SREBP1c信号通路有关。

小编有话说：

本文采用250 μmol/L棕榈酸钠联合500 μmol/L油酸钠成功建立了稳定的HepG2细胞脂肪肝模型，该模型不仅表现出明显的脂质沉积特征，还伴随炎症反应和氧化应激状态。在细胞处理方法上，研究通过预实验确定了祛湿活血方含药血清的安全浓度范围，并采用高剂量血清进行后续机制研究。通过设立正常对照组、模型组、祛湿活血方干预组以及AMPK抑制剂对照组，系统验证了祛湿活血方的作用效果及其对AMPK/SREBP1c通路的调控作用。实验过程中采用的油红O染色、脂质荧光染色、酶学检测以及分子生物学技术等方法，为全面评估祛湿活血方干预效果提供了可靠的技术支撑。

值得关注的是，实验中使用的棕榈酸钠和油酸钠作为关键的高脂诱导剂，其稳定的纯度和可靠的实验效果为脂肪肝细胞模型的成功建立提供了保障。未来研究可进一步优化脂质诱导方案，结合更先进的多组学技术深入揭示祛湿活血方的多靶点作用机制，为中药复方治疗MASLD的临床应用提供更充分的科学依据。相关试剂产品将继续为脂肪肝发病机制研究和药物筛选提供稳定可靠的技术支持。

参考文献

谭伟强，龚晓倩，王蓉蓉，等. 祛湿活血方调控AMPK/SREBP1c信号通路对HepG2脂肪肝细胞生长的影响[J]. 实用医学杂志, 2026, 42(3): 406-415. DOI: 10.3969/j.issn.1006-5725.2026.03.007.