高脂细胞添加剂（棕榈酸钠、油酸钠）诱导肝细胞（HepG2、AML12）以建立MASLD肝细胞模型

1. 前言

本研究聚焦于代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的发病机制，其核心病理特征为肝细胞内甘油三酯（TG）异常蓄积，进而引发脂毒性、内质网应激（ERS）和氧化应激，形成恶性循环，推动疾病进展。核因子κB p65（ReIA）与肝细胞核因子-1α（HNF1α）构成的信号通路在维持肝脏脂质代谢稳态中发挥关键作用，但在MASLD状态下该信号受损，导致未折叠蛋白反应（UPR）的适应性功能下降，加剧TG代谢失衡与ERS。白及多糖（BSP）作为一种天然活性多糖，前期研究显示其可能通过调控ReIA/HNF1α信号缓解肝脂肪变性，但其具体机制尚不明确。本研究综合运用动物模型、细胞实验及脂质组学等多学科技术，系统揭示ReIA/HNF1α信号在MASLD中的调控作用及BSP的治疗潜力。

本研究的技术路线围绕“信号受损-机制解析-治疗干预”主线展开：首先通过高脂饮食喂养小鼠及肝细胞模型模拟MASLD病理状态，明确ReIA/HNF1α信号的变化及其与TG代谢失衡、ERS的关联；进而利用基因敲除、过表达及双荧光素酶报告基因等技术，深入探讨ReIA与HNF1α之间的正反馈调控关系及其对下游UPR关键分子（如ATF4、GRP78）的转录调控作用；最后通过BSP干预实验，验证其通过恢复ReIA/HNF1α信号活性缓解MASLD的疗效。

在细胞实验方面，本研究主要采用人肝细胞系HepG2和小鼠肝细胞系AML-12，通过油酸钠（SO）和棕榈酸钠（SP）联合处理模拟MASLD的脂质蓄积环境。实验内容包括：梯度浓度SO/SP处理以确定最佳造模条件；油红O染色观察脂滴形成；CCK-8法检测细胞活力；Western blot分析ReIA、HNF1α、TG代谢相关蛋白（SREBP1c、MTP、MCAD）、ERS标志物（ATF4、GRP78、CHOP）及细胞死亡相关蛋白（cleaved caspase-3、p-MLKL）；流式细胞术评估细胞凋亡；此外，还通过基因敲除（sgRNA）和过表达（pcDNA）技术调控ReIA/HNF1α表达，并结合双荧光素酶报告基因实验验证其相互调控关系及对ATF4启动子的激活作用。

2. 高脂细胞添加剂

文中利用不同浓度梯度的棕榈酸钠、油酸钠（货号KC006，鲲创科技）联合诱导肝细胞（HepG2、AML12）以建立MASLD肝细胞模型，分析肝细胞脂肪变性的病理表型变化。

该试剂（KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。其中，棕榈酸钠可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸钠可以用来诱导细胞代谢异常。棕榈酸钠和油酸钠可以单独使用，也可以联合使用。需要说明的是，由于部分肝细胞较为敏感，某些情况下研究人员单独使用棕榈酸（钠）或油酸（钠）进行诱导也能获得理想的实验结果，但在研究代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）时，多数文献更推荐棕榈酸钠与油酸钠联合诱导的技术方案。

3.细胞处理

细胞实验内容以 HepG2 和 AML-12 肝细胞系为研究对象, 采用油酸钠（sodium oleate，SO）和棕榈酸钠（sodium palmitate，SP）联合处理两种细胞48h，以建立MASLD的细胞模型。

1）HepG2细胞

HepG2细胞实验分为4组：

MASLD模型组（SO/SP）：分别以125/62.5、250/125和500/250μM的SO/SP浓度梯度孵育细胞。

溶剂对照组（control）：以等体积溶剂牛血清白蛋白（albumin from bovineserum，BSA）溶液代替SO/SP混合液处理细胞48h。

通过以下方法验证MASLD细胞模型：油红O染色观察细胞内脂滴蓄积，乙酰丙酮法检测细胞内TG含量，CCK-8检测肝细胞活力变化，WB检测细胞凋亡标志蛋白cleaved caspase-3及程序性坏死标志蛋白p-MLKL的表达水平。基于脂质蓄积程度、细胞活力及程序性死亡途径激活水平，确定SO/SP诱导HepG2细胞的最佳浓度为250/125μM。

2）AML-12细胞

用SO/SP处理AML-12细胞48h，模拟MASLD的细胞模型。AML-12细胞实验分为2组：

MASLD模型组（SO/SP）：采用上述筛选的最佳SO/SP浓度250/125μM孵育细胞48h。

溶剂对照组（control）：等体积的BSA溶液孵育细胞48h。

4.部分实验结果

1）MASLD细胞模型的建立与表型验证

通过SO/SP联合处理肝细胞，油酸钠（SO）和棕榈酸钠（SP）联合诱导脂滴形成（250/125 μM，48 h），成功模拟MASLD病理状态：

脂质蓄积：油红O染色显示大量红色脂滴（>3倍vs.对照组），细胞内TG含量显著升高（P<0.01，附图1B）；

细胞损伤：CCK-8检测表明细胞活力下降30%，同时凋亡标志物cleaved caspase-3及程序性坏死蛋白p-MLKL表达上调；

氧化应激与ERS：活性氧（ROS）探针DCFH-DA荧光强度增加2倍，MDA（脂质过氧化产物）升高而GSH（抗氧化剂）降低，同时ERS关键蛋白GRP78和CHOP表达上调。

图1MASLD 模型中肝细胞数据图

图中，图（A–E）使用不同浓度的SO/SP（125/62.5、250/125和500/250μM）孵育HepG2细胞48h以复制MASLD肝细胞模型，并以溶剂BSA为对照。在此条件下，评估（A）油红O染色的脂滴形成、（B）细胞内TG水平、（C）细胞活力、（D）cleaved caspase-3及p-MLKL的蛋白质表达水平和（E）RelA及HNF1α的蛋白质表达水平。（F–J）使用250/125 μM SO/SP孵育AML-12细胞48h以溶剂BSA为对照。在此条件下，评估（F）油红O染色脂滴形成、（G）细胞内TG水平变化、（H）细胞活力以及（I）cleaved caspase-3及p-MLKL的蛋白质表达水平和（E）RelA及HNF1α的蛋白质表达水平。a P<0.05，b P<0.01，与对照组比较；d P<0.01，与SO/SP组（125/62.5μM）比较；f P<0.01，与SO/SP组（250/125μM）比较。

图中，SO/SP处理以浓度依赖性方式诱导HepG2和AML-12细胞出现典型脂肪变性表型。随着SO/SP浓度升高，油红O染色显示细胞内脂滴显著增多，细胞内TG含量明显上升，尤其在250/125μM浓度下，TG水平较对照组增加超过2倍，细胞活力则显著下降,当SO/SP浓度达到500/250μM时，肝细胞的活力抑制率超过50%，表明其具有显著细胞毒性,为了确保实验的有效性并避免过度的细胞毒性对实验结果的影响，在后续的实验中选择中浓度的SO/SP（250/125μM）的用于后续MASLD肝细胞模型的相关研究。Western blot结果进一步显示，MASLD肝细胞中ReIA和HNF1α蛋白表达同步下调，同时伴随SREBP1c表达上调、MTP和MCAD表达下降，提示TG合成增强而分解与外排受阻。此外，ERS相关蛋白GRP78、ATF4和CHOP表达升高，表明ERS被激活。在细胞死亡方面，cleaved caspase-3和p-MLKL蛋白水平上升，流式细胞术检测到凋亡率显著增加，提示凋亡与程序性坏死均参与MASLD肝细胞损伤。

2） RelA/HNF1α信号的核心调控作用

敲除/过表达 Rela 或 Hnf1a，分析脂质沉积（油红O染色）、TG含量、细胞活力（CCK-8）、ERS及死亡信号（cleaved caspase-3、p-MLKL），基因操作实验揭示： 

敲除 Rela 或 Hnf1a：加剧SO/SP诱导的脂质沉积（脂滴面积增加40%）和细胞死亡（cleaved caspase-3升高50%）； 

过表达 Rela：显著减少脂滴形成，并促进TG分泌（上清TG水平升高25%），同时上调ATF4/GRP78（保护性ERS通路）和GPX4（抗氧化酶）； 

双荧光素酶报告基因：证实RelA直接结合 Hnf1a 启动子（WT荧光素酶活性升高3倍，突变体无响应），二者共同激活 Atf4 转录，形成正反馈调控环。 

其中，通过sgRNA敲除Rela或Hnf1a基因，发现敲除任一组分均导致另一组分表达下降，双荧光素酶报告基因实验证实ReIA与HNF1α之间存在正反馈调控机制：过表达ReIA可激活Hnf1a启动子，而启动子突变则削弱此效应；反之，HNF1α过表达也能激活Rela启动子。这种相互激活关系在MASLD状态下被破坏，导致信号通路功能受损。

3）BSP的治疗机制与RelA依赖性

BSP及其含药血清干预，评估对脂代谢和氧化应激的改善作用，BSP干预实验显示：

直接效应：0.2g/kg BSP处理MASLD肝细胞后，脂滴减少50%，RelA和HNF1α蛋白表达恢复至正常水平；

含药血清验证：BSP灌胃大鼠血清同样逆转脂质蓄积和ERS，证明其活性成分可通过体液循环起效；

关键依赖途径：当Rela敲除后，BSP的改善作用完全消失（脂滴、TG含量、细胞死亡指标与未治疗组无差异），证实RelA是BSP的核心靶点。

在机制层面，敲除Rela或Hnf1a均下调ATF4和GRP78表达，上调CHOP和HRD1，加剧ERS并促进细胞凋亡与程序性坏死；而过表达Rela则能逆转这些变化，减轻脂质蓄积和细胞损伤。这些结果充分说明，ReIA/HNF1α信号在维持肝细胞脂质稳态和ERS适应性应答中发挥核心作用，其受损是推动MASLD进展的关键环节。

小编有话说：

在油酸钠和棕榈酸钠实验方面，本研究系统评估了SO/SP作为高脂诱导剂在构建MASLD肝细胞模型中的应用效果。方法上，采用不同浓度梯度（125/62.5、250/125、500/250 μM）处理HepG2和AML-12细胞48小时，通过油红O染色、TG含量测定、CCK-8活力检测及Western blot等多指标验证模型可靠性。结果表明，250/125 μM SO/SP可有效诱导肝细胞脂肪变性，表现为脂滴大量形成、细胞内TG显著积累、细胞活力下降，并伴随ReIA/HNF1α信号受损、ERS激活及细胞死亡通路启动，为后续机制研究提供了稳定的体外模型基础。本研究所用油酸钠和棕榈酸钠高脂细胞添加剂货号为KC006，其高纯度和稳定性为MASLD细胞模型的成功构建提供了可靠保障。

参考文献

何毅怀.肝细胞RelA/HNF1α信号受损促进MASLD进展的机制与白及多糖的治疗作用研究[D]，新疆医科大学,2025.