INT J BIOL SCI （IF/ 10）：游离脂肪酸（油酸钠、棕榈油酸、硬脂酸钠）处理肠上皮细胞（HIEC、IEC-6）以研究其内质网应激与脂代谢调控

1. 研究背景

放射治疗是恶性肿瘤的重要治疗手段，但正常组织尤其是肠道上皮对电离辐射高度敏感，可导致放射性肠损伤。目前临床可用的辐射防护剂如氨磷汀因副作用显著、患者耐受性差而应用受限。近年来，肠道菌群及其代谢物在调节肠道稳态和应激反应中的作用受到广泛关注。酪醇是一种由肠道菌群代谢酪氨酸产生的酚类化合物，存在于橄榄油等食物中，具有抗炎和肠道保护活性，但其在辐射损伤中的具体作用和分子机制尚不明确。硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）是定位于内质网的脂代谢关键酶，催化饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸，对维持内质网膜流动性和功能完整性至关重要。本研究首次发现，辐射处理后小鼠粪便中酪醇水平升高，外源性酪醇可通过直接结合并稳定SCD1蛋白，促进单不饱和脂肪酸合成，进而抑制内质网应激，减轻肠道上皮细胞辐射损伤。

2. 技术路线

研究者首先通过非靶向代谢组学筛选出经辐射后升高的肠道代谢物酪醇，并在全身照射和腹部照射小鼠模型中验证外源性酪醇的辐射防护效果。通过网络药理学预测结合体外细胞实验，锁定SCD1为酪醇的直接靶点。利用慢病毒介导的基因敲低/过表达、点突变体、药物抑制和脂肪酸补充等多种策略，结合分子动力学模拟和药物亲和反应靶点稳定性实验，阐明酪醇通过结合SCD1并抑制VCP（Valosin-Holding Protein）介导的蛋白酶体降解，增强其酶活性，从而抑制内质网应激信号通路的分子机制。

细胞实验主要采用人肠上皮细胞和大鼠肠上皮细胞系。细胞接受8 Gy X射线照射前给予酪醇预处理，通过CCK8、LDH释放及Calcein-AM/PI染色评估细胞活力，Western blot检测内质网应激标志蛋白及SCD1表达水平，脂质组学分析脂肪酸组成。同时构建SCD1稳定敲低和过表达细胞株，并引入SCD1点突变体，结合外源补充油酸钠、棕榈油酸或硬脂酸钠，深入解析酪醇-SCD1-单不饱和脂肪酸轴的信号调控网络。

3. 棕榈酸高脂细胞添加剂

本文在体外细胞模型中，使用油酸钠、棕榈油酸、硬脂酸钠处理肠上皮细胞（HIEC、IEC-6）以研究其内质网应激与脂代谢调控。

该油酸钠高脂细胞添加剂（货号KC005）包括了独立包装的12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，该硬脂酸钠高脂细胞添加剂（货号KC007）包括了独立包装的6 mmol/L硬脂酸钠以及溶剂对照，棕榈油酸高脂细胞添加剂（货号KC010）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈油酸以及溶剂对照。上述试剂均与其他现有品牌高脂细胞添加剂相比，具有如下显著优点：

1）该高脂细胞添加剂为无菌液体溶液，浓度准确，可以直接按比例溶解在细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。

2）该棕榈酸高脂细胞添加剂的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。

3）该棕榈酸高脂细胞添加剂低温无析出、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

针对不同细胞种类及实验目的，本产品所用浓度不同，一般与培养基总体积按比例稀释，建议的终浓度范围为50-500 μmol/L。对于首次使用本产品，建议采用浓度梯度处理细胞，摸索针对特定细胞、达到特定效果的适宜浓度。处理时间上可通过镜下观察细胞状态初步判断，一般24-48小时为宜。

4. 实验内容

在细胞安全性评估中，作者首先确认酪醇对正常肠上皮细胞无明显毒性。CCK8结果显示，在HIEC细胞中酪醇浓度高达100 μM、IEC-6细胞中高达400 μM时，细胞活力均未受影响。接着，作者采用8 Gy X射线照射细胞，并于72小时后检测损伤指标。LDH释放实验显示，酪醇呈剂量依赖性地降低辐射后两种细胞的上清LDH活性，其中HIEC细胞在75 μM、IEC-6细胞在200 μM时保护效果最显著。同时，活死细胞染色显示：与辐照对照组大量PI染色的红色死细胞相比，酪醇预处理组Calcein-AM标记的绿色活细胞显著增多，死细胞比例下降。这些数据奠定了酪醇的细胞辐射防护基础。

为探索分子机制，作者聚焦内质网应激通路。如图1C所示，8 Gy辐照后12小时，HIEC细胞中p-eIF2α/eIF2α比值、ATF4和CHOP蛋白水平均显著上升，而酪醇预处理可明显抑制这些标志物的表达。进一步地，作者使用内质网应激抑制剂4-PBA和TUDCA，单独给予这些抑制剂可减轻辐射损伤，但与酪醇联用时并无叠加效应；相反，使用内质网应激诱导剂毒胡萝卜素（如图1B）则完全消除酪醇的保护作用，这证明酪醇正是通过抑制内质网应激来发挥细胞保护功能。

通过网络药理学，作者预测SCD1为酪醇的潜在靶点。Western blot结果（如图1E和1F）显示，辐射处理后SCD1蛋白表达下降，而酪醇处理可恢复其水平。为了验证SCD1的功能必要性，作者构建了SCD1过表达和敲低的稳定细胞株。如图1G所示，SCD1过表达显著抑制了辐射诱导的p-eIF2α、ATF4和CHOP升高，且LDH释放减少（如图2A）。相反，如图1H及图2B所示，敲低SCD1后，内质网应激加剧，酪醇的细胞保护效果完全丧失。值得注意的是，向SCD1敲低细胞中补充SCD1的酶促产物——75 μM油酸钠或棕榈油酸（如图1H右侧量化及图2B），能够重新降低LDH释放并抑制内质网应激蛋白表达，而补充底物硬脂酸则无效。另外，在SCD1敲低细胞中重新引入野生型SCD1（如图2C）能完全挽救酪醇的保护作用，这明确表明SCD1的酶活性是酪醇发挥辐射防护所必需的。

图1.酪醇以SCD1依赖的方式减轻辐射诱导的内质网应激

图2.酪醇以一种SCD1依赖的方式减轻RIII

作者进一步探究酪醇如何维持SCD1蛋白水平。放线菌酮追踪实验显示，酪醇显著延缓了辐射后SCD1蛋白的降解。使用蛋白酶体抑制剂MG132而非溶酶体抑制剂亮抑酶肽，以及泛素激活酶抑制剂TAK-243，均可阻断辐射诱导的SCD1下降，提示泛素-蛋白酶体途径参与其中。有趣的是，免疫共沉淀未发现辐射后SCD1泛素化水平明显改变，但VCP（负责将泛素化底物递送至蛋白酶体）与SCD1的相互作用在辐射后增强，而酪醇处理可减弱这一互作。使用VCP抑制剂NMS-873或siRNA敲低VCP均能抑制辐射诱导的SCD1降解。免疫荧光染色进一步证实，酪醇处理可维持SCD1蛋白水平并增强其与内质网标志物PDI的共定位。脂质组学分析表明，辐射导致油酸钠和棕榈油酸水平下降、硬脂酸钠和棕榈酸水平上升，而酪醇处理显著恢复油酸钠/硬脂酸钠和棕榈油酸/棕榈酸比值，证实酪醇增强了SCD1酶活性。

最后，作者通过分子模拟和突变实验确认酪醇直接结合SCD1。分子对接显示酪醇与SCD1的Asn148、Asp156和Asn265形成氢键，结合能为-6.3 kcal/mol；分子动力学模拟证实复合物稳定。药物亲和反应靶点稳定性实验表明，酪醇能保护野生型SCD1但无法保护三点突变体。功能上，将SCD1突变体导入敲低细胞后，酪醇既不能降低LDH释放，也无法抑制内质网应激，有力证明酪醇通过直接结合SCD1发挥细胞保护作用。

5. 总结

放射性肠损伤(RIII)是放射治疗的一种主要的临床顽固性并发症，目前的保护措施仍然非常有限。在这项研究中，我们确定酪醇是一种来自肠道的酚类代谢物，富含在受辐射的小鼠的粪便中，是一种有效的辐射防护剂。它通过保护粘膜屏障和绒毛-隐窝结构，并下调促炎细胞因子，减少了致死性照射小鼠的肠道上皮细胞死亡，提高了存活率。在机理上，我们首次揭示了酪醇直接靶向硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)，这是参与单不饱和脂肪酸(MUFA)生物合成的关键酶。酪醇与SCD1上的保守残基(Asn148、Asp156、Asn265)结合，阻止Valosin-HoldingProtein(VCP)介导的蛋白酶体降解。这增加了SCD1的活性，增加了MUFA(如油酸钠、棕榈油酸)，通过p-eIF2α/ATF4/CHOP轴抑制内质网应激，减轻辐射诱导的细胞毒性。重要的是，在动物实验中抑制SCD1拮抗了酪醇的保护作用，证实了SCD1的辐射保护效应。此外，补充MUFA可以恢复SCD1缺陷细胞中酪醇的辐射防护效应。这些发现阐明了一种新的机制，即肠道代谢产物通过脂质重塑来提供辐射防护，并强调SCD1激活是一种有前景的胃肠道辐射损伤的治疗策略。

小编有话说：

关于脂肪酸补充实验，作者发现在SCD1敲低或药物抑制条件下，外源性补充75 μM油酸钠或棕榈油酸（而非硬脂酸）可完全恢复酪醇的辐射保护效果，表现为LDH释放下降和内质网应激标志物被抑制，这明确证明单不饱和脂肪酸是SCD1介导辐射防护的关键下游效应分子。细胞处理材料与方法：HIEC和IEC-6细胞培养于含10% FBS及双抗的DMEM中，酪醇预处理24小时，辐射前2小时加入相应抑制剂，游离脂肪酸（油酸钠、硬脂酸钠、棕榈油酸）以75 μM浓度处理24小时，照射剂量为8 Gy X射线。鲲创科技可为您提供上述高纯度细胞级别油酸钠、硬脂酸钠和棕榈油酸钠，批次稳定、质控严格，助力您在内质网应激与脂代谢调控研究中的精准干预。

参考文献

Jin, X., Xue, H., Shi, X., Zhou, Y., Zhang, J., Zeng, L., … Zheng, Y. (2026). Gut Microbiota-Derived Tyrosol Alleviates Radiation-Induced Intestinal Injury via Targeting SCD1-MUFA Axis to Suppress ER Stress. International Journal of Biological Sciences, 22(5), 2469–2491.