Cardiovascular Diabetology（IF: 10.6）高糖联合棕榈酸钠处理AC16心肌细胞模拟射血分数保留型心衰（HFpEF）代谢应激

1. 研究背景

HFpEF（射血分数保留型心衰）已成为全球心衰的主要亚型，其核心病理机制是心肌细胞能量代谢紊乱，表现为线粒体功能障碍、ATP生成减少及代谢通路（如TCA循环）受损。琥珀酸（succinate）作为TCA循环的关键中间产物，在HFpEF患者和小鼠模型的心肌组织中显著降低。除代谢功能外，琥珀酸通过其受体GPR91（SUCNR1）调控糖脂代谢、炎症和能量稳态，其信号失调与肥胖、糖尿病等HFpEF合并症密切相关。此外，AMPK活性下降和NAD⁺耗竭是HFpEF的典型特征，二者作为能量代谢的核心调控因子，可能受琥珀酸-GPR91轴的影响，但具体机制尚未阐明。

2. 技术路线

本研究采用高脂饮食（HFD）联合L-NAME建立HFpEF小鼠模型，通过对比野生型（WT）、全身性GPR91敲除（Gpr91^⁻/⁻）型及心肌细胞特异性敲除（Gpr91ᴬᶜᴹ）型小鼠，探究琥珀酸补充的疗效及机制。通过超声心动图、组织学分析和分子检测评估心脏功能与代谢表型；结合心肌转录组测序筛选琥珀酸-GPR91调控的通路；进一步在AC16心肌细胞系和hiPSC来源心脏类器官中验证下游分子机制（如AMPK/NAD⁺通路），并通过Gq抑制剂（YM-254890）和烟酰胺挽救实验，明确琥珀酸-GPR91信号通路的因果调控作用。

3. 高脂细胞添加剂

在体外模型中，使用棕榈酸钠作为高脂细胞添加剂联合葡萄糖处理AC16心肌细胞，模拟射血分数保留型心衰（HFpEF）代谢应激。棕榈酸钠作为游离脂肪酸可以用来诱导绝大数细胞的损伤和炎症。

该高脂细胞添加剂（货号KC002）包括了独立包装的10 mmol/L棕榈酸钠和溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的棕榈酸钠相比，具有如下显著优点：

1）该棕榈酸钠为液体溶液，浓度准确，可以直接溶解在细胞培养基中，无需繁琐的配制工作。

2）该棕榈酸钠的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。

3）该棕榈酸钠溶液常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

其中，也可以直接使用高糖高脂试剂盒（KT001），该试剂盒包括了独立包装的10 mmol/L的棕榈酸钠、1 mol/L的葡萄糖、1 mol/L的甘露醇以及高脂对照，适用于所有常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

4. 细胞实验内容

细胞实验聚焦琥珀酸-GPR91信号对心肌代谢的重编程作用，包括三方面内容：1）AC16心肌细胞：高糖（33mM）联合棕榈酸（200μM,HG+PA）处理48小时模拟HFpEF代谢应激，检测GPR91表达及琥珀酸（400μM）对AMPK磷酸化的调控；2）hiPSC心脏类器官：暴露于HFpEF样合并症条件（炎症因子+高糖+血管紧张素Ⅱ），分析GPR91蛋白表达；3）原代新生小鼠心肌细胞（NMCMs）：分离自WT与Gpr91⁻/⁻小鼠，用于验证琥珀酸信号的细胞自主性。细胞实验是阐明琥珀酸-GPR91通路机制的关键环节，其结果与动物模型相互印证，其中细胞实验核心发现与机制解析如下：

1. HFpEF应激下调GPR91表达

在AC16心肌细胞中，高糖+棕榈酸（HG+PA）处理48小时显著降低GPR91蛋白表达（图1E），与HFpEF小鼠心肌组织的结果一致（图1D）。同样，hiPSC来源的心脏类器官在模拟HFpEF合并症（肥胖+糖尿病+高血压）后，GPR91表达亦明显下调（图1F）。这些数据证实代谢应激直接损害心肌细胞GPR91受体，为琥珀酸信号障碍提供细胞水平证据。

2.琥珀酸通过GPR91-Gq-AMPK轴激活代谢重编程 

机制研究发现，琥珀酸通过GPR91受体激活Gq蛋白依赖性信号： 

AMPK磷酸化调控：在HG+PA处理的AC16细胞中，琥珀酸（400 μM）处理5分钟可显著增强AMPK磷酸化（图2A），但该效应被Gq抑制剂YM-254890（1 μM）完全阻断（图2B），表明Gq是琥珀酸下游的关键信号节点。 

NAD⁺生物合成促进：延长琥珀酸处理至24小时，可上调NAD⁺合成限速酶Nampt的表达并抑制消耗酶CD38，从而提升细胞内NAD⁺水平（图2C-D）。这种调控依赖于GPR91，因Gq抑制后Nampt上调和CD38下调消失。 

图示关联中，图2的Western blot与NAD⁺检测数据直观显示，琥珀酸通过Gq-AMPK轴激活Nampt（烟酰胺磷酸核糖转移酶），驱动NAD⁺生成，改善细胞能量代谢。

3.GPR91缺失导致代谢挽救失效

在原代新生小鼠心肌细胞（NMCMs）中，Gpr91^⁻/⁻细胞在琥珀酸刺激下无法激活AMPK或提升NAD⁺水平，直接证明琥珀酸的代谢保护作用严格依赖GPR91受体。此外，烟酰胺（NAD⁺前体）可部分逆转Gpr91^⁻/⁻细胞的代谢缺陷，提示NAD⁺恢复是琥珀酸-GPR91下游的核心效应。

4.心脏类器官验证病理表型

hiPSC类器官在HFpEF样条件下出现GPR91下调（图1F），且伴随AMPK活性降低和脂质积累（油红O染色），进一步在复杂三维模型中重现HFpEF的代谢紊乱特征，为临床转化提供人源化模型基础。

图1  射血分数保留的心力衰竭中，琥珀酸水平降低及其受体GPR91表达下调。A，HFpEF患者心脏组织中的琥珀酸水平，基于一项已发表的研究的靶向代谢组学数据。B，用比色法测定WT普通饮食（RC）和HFpEF小鼠心脏组织中的琥珀酸水平。N=每组6人。C、WTRC和HFpEF小鼠心脏组织中GPR91 mRNA的表达水平。WTRC组n=6，WTHFpEF组n=9。D，Western印迹分析和定量检测GPR91在对照组小鼠心脏组织中的表达，并与db/db或HFpEF小鼠进行比较。N=每组6人。E、Western印迹分析和定量检测对照组和HG+PA培养48h的AC16心肌细胞GPR91的表达（n=3）。F，Western印迹分析和定量GPR91在人iPSC衍生的心脏器官中的表达，暴露于对照组或HFpEF样共病条件下（每组3例）。G，RC和HFpEF小鼠心脏GPR91（红色）免疫荧光染色的代表性图像，以及相应的GPR91荧光强度的量化。N=每组7例。所有数据均以平均值±标准差表示。P < 0.05被认为具有统计意义，精确值在相应的数字中给出。数据分析采用Kruskal-Wallis检验，或调整后的P值，或t检验（B-H）。

图2  琥珀酸改善HFpEF舒张功能障碍的作用依赖于心肌细胞GPR91

5. 总结

心肌细胞能量代谢紊乱是射血分数保留的心力衰竭的标志。琥珀酸是三羧酸循环的关键中间体，在HFpEF心肌中显著减少。除了其代谢作用外，琥珀酸通过激活GPR91来调节代谢和免疫途径。然而，心肌细胞琥珀酸-GPR91信号在HFpEF发病机制中的确切作用和机制仍不完全清楚。文章通过建立野生型（WT）、全身GPR91基因敲除（GPR91^-/-）和心肌细胞特异性GPR91基因敲除（GPR91^ΔCM）小鼠模型，心脏结构、功能和代谢表型通过超声心动图、组织学和分子分析进行评估。对心肌组织进行转录组测序，以确定琥珀酸-GPR91信号调节的途径。在人AC16心肌细胞系中进行了机制研究，以验证信号通路的调控，并阐明下游的分子机制。此外，还进行了挽救实验，以确认琥珀酸-GPR91信号在心肌细胞代谢和HFpEF进展中的功能相关性。HFpEF组小鼠心脏琥珀酸水平和GPR91表达明显降低。补充琥珀酸可恢复野生型（WT）HFpEF小鼠的全身代谢稳态，改善舒张功能，并减轻心肌肥大与纤维化；而在GPR91全身敲除（GPR91^-/-）及心肌细胞特异性敲除（GPR91^-/-ΔCM）小鼠中，上述保护效应均被消除。转录组分析表明，琥珀酸激活了Gpr91^fl/fl的AMPK信号通路，丰富了与糖脂代谢和NAD⁺生物合成相关的途径，但在Gpr91^fl/fl的ΔCM中没有。机制上，琥珀酸通过Gq介导的信号通路促进AMPK的磷酸化和NAD⁺的产生，从而促进心肌细胞代谢重编程。最后得出琥珀酸-GPR91轴是心脏代谢稳态的重要调节因子，是HFpEF潜在的治疗靶点。

小编有话说：

棕榈酸（200 μM）作为高脂应激的核心诱导剂，与高糖（33 mM）协同建立AC16心肌细胞系的HFpEF代谢模型（Methods/Cell culture）。该处理持续48小时，有效模拟HFpEF患者的脂毒性微环境，导致GPR91表达抑制、AMPK活性下降及NAD⁺耗竭。细胞预处理Gq抑制剂YM-254890（1 μM, 1小时）后再给予琥珀酸，明确揭示了Gq-AMPK-NAD⁺轴的级联调控机制。该稳定的细胞模型是靶向GPR91药物筛选的理想工具。

鲲创品牌（Kunchuang）的棕榈酸钠（货号KC002）作为高纯度代谢应激诱导剂，在研究中可用来模拟HFpEF心肌脂毒性损伤，为机制解析奠定基础。其稳定的化学性质与生物活性，可广泛用于心血管代谢疾病模型构建。未来研究可进一步探索GPR91激动剂或NAD⁺增强剂（如烟酰胺）的联合干预策略，推动HFpEF代谢疗法的临床转化。鲲创品牌（Kunchuang）提供的高品质的多种游离脂肪酸（Free Fatty Acid）将继续支持心血管领域创新研究。

参考文献

JIA Y, NIU W, LIU L, et al. Succinate–GPR91 signaling promotes cardiomyocyte metabolic reprogramming and NAD⁺ production to alleviate HFpEF[J/OL]. Cardiovascular Diabetology, 2026, 25(5). DOI:10.1186/s12933-025-03030-x.