Cell Metabolism（IF 30.9）：油酸/棕榈酸诱导肝细胞（HHL5人胚胎肝细胞系、原代肝细胞、LX-2肝星状细胞）脂肪变性以模拟肝脏脂质堆积

1. 研究背景

在细胞生物学领域，无膜细胞器（如核仁、应激颗粒等）通过液-液相分离动态组装，在生理病理过程中扮演着关键角色，其新成员的发现一直是前沿热点。DEAD-box解旋酶（DDX）家族成员因其普遍含有固有无序区域而具备发生液-液相分离的潜力，成为构建无膜细胞器的潜在支架蛋白，然而它们在肝脏疾病，特别是代谢性肝病中的作用鲜为人知。与此同时，全球范围内代谢功能障碍相关脂肪性肝病及其严重形式——代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的患病率逐年攀升，其中MASH不仅表现为肝脏脂肪变性，更以肝细胞损伤、炎症和纤维化为特征，是进展为肝硬化、肝癌的关键环节。肝纤维化的核心机制是活化的肝星状细胞过度产生细胞外基质，而肝细胞在此过程中分泌的“肝因子”至关重要。在脂肪变性的肝细胞应激环境下，已知的应激颗粒等无膜细胞器已被证明参与调控，但一个悬而未决的核心科学问题是：在MASLD/MASH进程中，肝细胞是否会通过具有相分离潜力的支架蛋白组装出全新的无膜细胞器，以应对脂质堆积的压力并影响疾病进展？这一探索对于理解肝脏代谢应激的细胞自适应机制和寻找新的干预靶点具有重要意义。

2. 技术路线

为系统性回答上述问题，本研究首先对DDX家族成员进行了筛选，锁定在脂质刺激下发生相分离的DDX49，并将其组装的新型颗粒命名为脂质诱导颗粒。研究技术路线贯穿于发现与验证：通过体内外脂质刺激模型结合免疫荧光、FRAP等技术确认DDX49的相分离特性；利用非靶向代谢组学锁定关键诱导代谢物并验证其与DDX49的互作；构建肝细胞特异性基因敲除小鼠明确LIG的体内功能；最后通过RIP-seq、蛋白质组学、共培养体系及多种分子互作检测，层层剖析LIG通过招募m5C修饰的Timp2 mRNA及其阅读器YBX1来抑制TIMP2蛋白翻译，从而反馈缓解肝纤维化的完整分子通路。

在细胞实验部分，研究者综合运用了多种细胞模型来验证机制：使用人胚胎肝细胞系HHL5和原代肝细胞作为脂肪变性肝细胞模型，用于观察DDX49相分离、LIG形成及代谢物刺激实验；同时，采用人肝星状细胞系LX-2和原代肝星状细胞作为纤维化效应细胞模型，通过条件培养基共培养体系，研究肝细胞来源的LIG对肝星状细胞活化的调控作用。关键技术包括荧光标记与活细胞成像、荧光漂白恢复实验、免疫共沉淀、RNA免疫共沉淀测序以及建立专门的LIG分离纯化方案等，在细胞层面完整揭示了从脂质刺激到LIG组装再到下游信号调控的动态过程。

3. 高脂细胞添加剂

本文在体外细胞模型中，使用油酸（钠）、棕榈酸（钠）作为高脂细胞添加剂诱导肝细胞（HHL5人胚胎肝细胞系、原代肝细胞、LX-2肝星状细胞）脂肪变性以模拟肝脏脂质堆积，帮助分析代谢功能障碍相关脂肪性肝炎的病理变化。

该高脂细胞添加剂（货号KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的油酸（钠）、棕榈酸（钠）相比，具有如下显著优点：

1）该试剂为液体溶液，浓度准确，可以直接溶解在细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。

2）该试剂的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。

3）该试剂常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

需要说明的是，棕榈酸（钠）可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸（钠）可以用来诱导细胞代谢异常。棕榈酸（钠）和油酸（钠）可以单独使用，也可以联合使用，棕榈酸（钠）和油酸（钠）联合诱导更加符合人体环境，适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

实际使用时，棕榈酸（钠）和油酸（钠）可以采用如下比例，直接加入完全培养基。

油酸（钠）：母液浓度12 mmol/L→作用浓度0.5 mmol/L，稀释了24倍； 

棕榈酸（钠）：母液浓度6 mmol/L→作用浓度0.25 mmol/L，稀释了24倍； 

24份总体积=1份油酸（钠）+1份棕榈酸（钠）+22份完全培养基； 

此时，以1.2 mL为例，油酸（钠）加1.2/24=0.05 mL，棕榈酸（钠）加1.2/24=0.05 mL，其余为完全培养基。以1mL为例，油酸（钠）加1/24=0.0417 mL，棕榈酸（钠）加1.2/24=0.0417 mL，其余为完全培养基。

4. 实验内容

在细胞实验中，研究者采用了包括HHL5细胞系、原代肝细胞及肝星状细胞在内的多种细胞模型。通过荧光标记、FRAP、免疫共沉淀、共培养体系以及LIG分离纯化等关键技术，在细胞层面直观证实了DDX49在油酸/棕榈酸刺激下发生相分离形成LIG的动态过程，并验证了LIG对肝星状细胞活化的调控作用及具体分子机制。

研究首先在细胞水平直观捕捉到了DDX49的相分离行为。如图1B和C所示，在OA/PA或MCD培养基刺激后，无论是外源表达的FLAG-DDX49还是内源性DDX49，均在肝细胞胞质内形成颗粒状结构，且该结构可被1,6-己二醇破坏，这符合LLPS的典型特征。为了证实这些凝聚物具有液体样特性，研究进行了FRAP实验（图1D），显示GFP-DDX49颗粒在光漂白后能快速恢复荧光，表明其内部分子具有高度流动性。同时，延时显微成像（图1E, F）清晰地记录了DDX49颗粒的融合与分裂事件，进一步支持了其液态属性。这些现象也在体外重组蛋白实验中得到了重现。通过截短体与突变体实验（图1H），研究将DDX49的相分离能力定位在其C末端的IDR区域，并发现该区域内的疏水基序至关重要。重要的是，如图1I所示，OA/PA诱导的DDX49凝聚物与已知的应激颗粒等无膜细胞器无共定位，结合其更大的尺寸，将其定义为一种新型颗粒——LIG。

图1. 在MASLD期间DDX49在脂肪变性肝细胞中经历IDR依赖的LLP

为了探究LIG的诱导因素，非靶向代谢组学分析（图2A）将目标锁定在花生四烯酸代谢通路。细胞实验表明，代谢物6-keto-PGF1α和PGF2α需协同作用才能有效诱导LIG形成（图2B, C），SPR和下拉实验（图2D-H）则直接证明了这两种代谢物与DDX49蛋白，特别是其IDR域的结合。研究者还成功建立了从脂变肝细胞中分离LIG的方案（图2I, J），并在分离的LIG中富集到了DDX49及诱导代谢物（图2K），为后续组分分析奠定了基础。

图2. AA代谢物促进DDX49组装LIG

在功能探究上，细胞共培养实验（图3A-D）提供了关键证据：OA/PA处理的肝细胞上清能激活肝星状细胞，而DDX49过表达则可抑制这种激活；相反，Ddx49敲除的肝细胞上清则表现出更强的促活化能力。这提示LIG通过调节肝细胞分泌的肝因子来发挥作用。随后的RIP-seq与蛋白质组学联合分析（图3E, F）锁定了关键肝因子TIMP2。细胞实验进一步证实，DDX49能结合Timp2 mRNA（图3K-M）并抑制其翻译（图4N），而不影响mRNA本身水平，这解释了LIG调控TIMP2产生的转录后机制。最后，对LIG组分及其互作蛋白的筛选发现，m5C阅读器蛋白YBX1在脂质刺激下与DDX49强烈结合，并将m5C修饰的Timp2 mRNA招募至LIG中，从而完整勾勒出“代谢物诱导DDX49相分离—组装LIG—招募YBX1及Timp2 mRNA—抑制翻译—减少TIMP2分泌—缓解纤维化”的细胞分子通路。

图3.Lig结合促纤维化的Timp2 mRNA并抑制其翻译

5. 总结

细胞内无膜细胞器，包括颗粒、小体、斑点等，在生理和病理过程中起着至关重要的作用。新的无膜细胞器的发现引起了人们的极大关注。DEAD-BOX解旋酶(DDX)家族成员具有液-液相分离的潜能，液-液相分离是组装无膜细胞器的基础。文章筛选了DDX家族成员，发现脂类，特别是花生四烯酸(AA)代谢产物可以诱导肝细胞中DDX49的LLP，形成一个被称为脂质诱导颗粒(LIG)的组装颗粒，以寻找在脂肪变性肝细胞中组装的新颗粒。DDX49反馈组装的Ligs抑制代谢功能障碍相关的脂肪变性肝病(MASLD)相关的纤维化。从机制上讲，C5-甲基胞嘧啶(M5C)修饰的肝细胞因子金属蛋白酶组织抑制因子2(Timp2)及其阅读器Y-box结合蛋白1(YBX1)的信使核糖核酸被整合到Ligs中，从而抑制Timp2mRNA的翻译，从而反馈抑制肝纤维化。此外，在人类MASLD肝脏中发现了Ligs，并与纤维化进展呈负相关。因此，在脂肪变性的肝细胞中发现了一种新的颗粒，并阐明了其抑制肝纤维化的作用。

小编有话说：

油酸（钠）、棕榈酸（钠）处理是本研究在细胞模型中模拟肝脏脂质堆积的核心手段。实验表明，这两种游离脂肪酸的混合能有效诱导肝细胞内DDX49发生液-液相分离，形成具有生物活性的LIG结构。这项突破性发现揭示了细胞应对代谢压力的一种新型自适应机制，也为靶向干预肝纤维化提供了全新思路。本研究采用的高脂细胞刺激剂（货号KC006）为无菌溶液，具有浓度准确、使用便捷、稳定性好等特点，为成功构建高度模拟代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）病理特征的细胞模型奠定了坚实基础。此外，鲲创科技还提供即用、无菌型液体花生四烯酸（AA）高脂细胞添加剂。

参考文献

LI Y, LEI T, NIE W, et al. Lipid-induced granules in hepatocytes alleviate liver fibrosis[J/OL]. Cell Metabolism, 2026. DOI:10.1016/j.cmet.2025.12.015.