油酸/棕榈酸刺激人肝癌细胞（HepG2）构建NAFLD细胞模型

1. 研究背景

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种全球范围内日益流行的慢性肝病，其发病机制复杂，涉及脂代谢紊乱、氧化应激和炎症反应等多重因素。目前临床尚缺乏特效治疗药物，生活方式干预仍是主要手段。近年来，铁死亡——一种铁依赖性的脂质过氧化驱动的细胞死亡方式——被证实与NAFLD的发生发展密切相关。肝细胞内铁过载和活性氧（ROS）累积可诱导铁死亡，加剧肝细胞损伤、炎症反应乃至纤维化。因此靶向抑制铁死亡成为NAFLD治疗的新兴策略。白桦脂酸（BA）作为一种源自白桦树皮的五环三萜类天然产物，前期研究显示其在改善代谢和抗炎等方面具有潜力，但其对抗NAFLD的具体分子机制，尤其是与铁死亡的关联，尚待深入阐明。

2. 技术路线

本研究采用体内外结合的技术路线系统探究BA的作用机制。在体内，通过高脂高胆固醇饮食联合葡聚糖硫酸钠诱导小鼠NAFLD模型；在体外，则利用油酸（OA）和棕榈酸（PA）混合刺激人肝癌细胞HepG2，构建脂肪变性细胞模型。研究综合运用了分子对接、生化指标检测、组织病理染色（HE、油红O）、荧光染色（尼罗红、ROS）以及蛋白与基因表达分析（Western blot, Real-time PCR）等多种技术，旨在阐明BA是否通过调节p53/GPX4信号轴来抑制铁死亡，从而发挥肝保护作用。

基于上述路线，本研究开展了一系列细胞实验。细胞实验部分聚焦于BA对OA/PA诱导的HepG2细胞模型的干预效果。实验设置了正常组、模型组（OA/PA）以及不同浓度的BA处理组，并进一步引入了p53基因敲低（sip53）组，以验证p53在BA作用通路中的关键角色。通过检测细胞内脂滴沉积、ROS水平以及铁死亡相关标志物（GPX4, SLC7A11, ACSL4, p53）的表达变化，深入探讨了BA的细胞保护机制。

3. 高脂细胞添加剂

本文在体外细胞模型中，使用油酸（钠）、棕榈酸（钠）作为高脂细胞添加剂处理人肝癌细胞（HepG2）构建NAFLD细胞模型，帮助分析非酒精性脂肪性肝病的病理变化。

该高脂细胞添加剂（货号KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的油酸（钠）、棕榈酸（钠）相比，具有如下显著优点：

1）该试剂为液体溶液，浓度准确，可以直接溶解在细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。

2）该试剂的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。

3）该试剂常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

需要说明的是，棕榈酸（钠）可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸（钠）可以用来诱导细胞代谢异常。棕榈酸（钠）和油酸（钠）可以单独使用，也可以联合使用，棕榈酸（钠）和油酸（钠）联合诱导更加符合人体环境，适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

实际使用时，棕榈酸（钠）和油酸（钠）可以采用如下比例，直接加入完全培养基。

油酸（钠）：母液浓度12 mmol/L→作用浓度0.5 mmol/L，稀释了24倍； 

棕榈酸（钠）：母液浓度6 mmol/L→作用浓度0.25 mmol/L，稀释了24倍； 

24份总体积=1份油酸（钠）+1份棕榈酸（钠）+22份完全培养基； 

此时，以1.2 mL为例，油酸（钠）加1.2/24=0.05 mL，棕榈酸（钠）加1.2/24=0.05 mL，其余为完全培养基；以1mL为例，油酸（钠）加1/24=0.0417 mL，棕榈酸（钠）加1.2/24=0.0417 mL，其余为完全培养基；

4. 实验内容

1）细胞培养、模型构建及分组

HepG2细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养于37℃，5% CO₂培养箱内。使用慢病毒LV-TP53-RNAi（1.2×10⁹ TU·mL^-1）构建敲低p53，使用OA/PA（500/250 μmol·L^-1）处理HepG2细胞48h构建NAFLD细胞模型，细胞实验分组：正常组，模型组（OA/PA），BA低、中、高浓度组（20、40、80 μmol·L^-1），OA/PA+BA组，sip53+OA/PA组，sip53+OA/PA+BA组，各组分别加OA/PA处理48h后换液加药处理。

2）BA 对HepG2 细胞中OA/PA 诱导NAFLD 细胞模型脂滴影响

在细胞实验中，OA/PA的刺激成功模拟了NAFLD的细胞特征，即脂质过度蓄积和氧化应激。如图1和图2所示，通过油红O染色和尼罗红荧光染色可以直观看到，模型组HepG2细胞的胞质内充满了大量被染成红色或亮红色荧光的脂滴，表明脂质沉积严重。然而，在BA干预后，细胞内的脂滴数量呈现剂量依赖性的显著减少，染色强度明显减弱，这直观证明了BA能够有效减轻肝细胞内的脂质堆积。

图1  BA对各组HepG2细胞脂质沉积的影响（油红O，×500）

进一步检测活性氧（ROS）水平发现，如图中荧光强度所示，模型组细胞内绿色荧光信号显著增强，提示ROS大量生成，氧化应激反应剧烈。而BA处理，特别是中、高剂量组，能够显著减弱这种荧光信号，表明BA有效清除了过量的ROS，减轻了细胞的氧化损伤。这些形态学和荧光强度的变化，为BA改善肝细胞脂肪变性和氧化应激提供了直接的可视化证据。

图2  BA对各组HepG2细胞脂质沉积的影响（尼罗红，×500）

图中，A为正常组，B为模型组，C为BA低剂量组，D为BA中剂量组，E为BA高剂量组。在OA/PA（500/250 μmol·L^-1）刺激下建立体外细胞脂肪变性模型，细胞增殖与活性检测（CCK-8）实验表明，在所测试的浓度下（20，40，80 μmol·L⁻¹），BA对HepG2细胞活力影响较小，此外OA/PA诱导的HepG2细胞在不同浓度的BA单体作用下细胞活力正常，结果表明，BA在0~80 μmol·L^-1是安全的。通过油红O染色观察到FFAs诱导的HepG2细胞脂滴沉积，在模型组中，脂滴大量积累在细胞质，BA处理后细胞脂质积累显著减少（P<0.01），药物浓度越高，脂滴积累越少，脂滴积累程度与药物浓度相关，此外通过尼罗红荧光染色各组细胞与油红O染色结果一致。

3）机制探究

研究通过Western blot检测了铁死亡通路关键蛋白的表达。在OA/PA刺激下，如图所示，促进铁死亡的蛋白ACSL4表达上调，而抑制铁死亡的关键蛋白GPX4和SLC7A11表达下调。BA处理逆转了这一趋势：随着BA浓度增加，ACSL4的蛋白条带变弱，而GPX4和SLC7A11的条带增强，表明BA能够重塑细胞的抗氧化防御体系，抑制铁死亡进程。

图3  各组HepG2 中p53、p-p53、GPX4、ACSL4、SLC7A11 蛋白表达

尤为关键的是对p53蛋白的检测。实验发现OA/PA刺激同时升高了p53及其磷酸化（p-p53）的表达。BA处理则能剂量依赖性地抑制p53的磷酸化激活。为了确证p53是BA发挥作用的核心靶点，研究者构建了p53敲低的稳转细胞株（sip53）。分子对接结果也显示BA能与p53蛋白有效结合。在sip53细胞中，无论是否加入BA，其改善脂滴沉积、上调GPX4/SLC7A11、下调ACSL4的效果都与单独敲低p53的效果相当，两者间无统计学差异。这一结果在对应的蛋白电泳图中得到了印证，即sip53组与BA+sip53组的蛋白表达模式相似，显著区别于OA/PA模型组和OA/PA+BA组。这强有力地证明，敲低p53足以消除BA对铁死亡的调控作用，BA正是通过靶向抑制p53（特别是其磷酸化激活）来调控下游的GPX4等分子，从而发挥抗铁死亡和肝细胞保护效应的。

5. 总结

综上所述，在利用油酸（钠）和棕榈酸（钠）混合刺激构建NAFLD细胞模型的研究中，BA展现出了明确的保护作用，能够剂量依赖性地减轻细胞内脂滴沉积、降低ROS水平，并通过抑制p53磷酸化来上调GPX4/SLC7A11、下调ACSL4，从而遏制铁死亡进程。在材料与方法部分，细胞处理流程严谨：HepG2细胞在含OA/PA的培养基中刺激48小时以诱导脂肪变性和铁死亡，随后进行BA给药或转换至含sip53的培养基进行干预，确保了模型稳定性和实验的可重复性。

小编有话说：

本研究所采用的高脂细胞刺激剂——油酸（钠）与棕榈酸（钠），作为精准模拟体内游离脂肪酸环境的经典工具，其纯度和稳定性对于实验结果的可靠性至关重要。本研究采用的高脂细胞刺激剂（货号KC006）为无菌溶液，具有浓度准确、使用便捷、稳定性好等特点，为成功构建高度模拟人类NAFLD病理特征的细胞模型奠定了坚实基础，助力于像BA这样的天然产物或其衍生物的机制研究。展望未来，基于此类可靠试剂构建的标准化模型，将持续推动靶向铁死亡等新机制的NAFLD治疗策略的探索与转化。

参考文献

唐高俊， 胡杰， 罗莉， 等。 白桦脂酸通过p53/GPX4信号轴抑制铁死亡缓解非酒精性脂肪性肝病的机制[J]. 中国实验方剂学杂志， 2025, 31(23): 85-96.