Marine Drugs（JCR Q1；IF 5.4）棕榈酸钠模拟高脂环境诱导肝细胞脂毒性以研究三种新型胶原肽对HepG2高脂损伤的改善作用

1. 研究背景

高脂血症是代谢综合征的核心病理特征，主要由脂质代谢紊乱和氧化应激引发，可导致非酒精性脂肪肝（NAFLD）等慢性肝病发生。棕榈酸钠（PANa）作为饱和脂肪酸的钠盐形式，能模拟高脂环境诱导肝细胞脂毒性，广泛应用于HepG2细胞脂代谢研究。近期研究发现，海洋胶原肽因其丰富的疏水性氨基酸（如亮氨酸、脯氨酸）和生物活性，在调节氧化应激与脂代谢中展现出潜力。然而，源自海洋鱼骨胶原的肽类在抗高脂血症中的作用机制尚未深入探索。本文以印度洋经济鱼种海鲶鱼（Harpadon nehereus）骨胶原为原料，聚焦其酶解产物中的三种新型肽LR-7（LALFVPR）、KA-8（KLHDEEVA）和PG-7（PSRILYG），探究其对棕榈酸钠（PANa）诱导的HepG2细胞高脂损伤的干预作用。

2. 技术路线

研究首先通过细胞毒性实验确定肽的安全浓度（≤200 μM）和棕榈酸钠（PANa）造模浓度（350 μM）。随后评估三种肽对PANa损伤的HepG2细胞的保护作用，包括细胞形态、存活率、抗氧化酶活性（CAT、SOD、GSH-Px、MDA）及Nrf2信号通路蛋白表达。进一步通过油红O染色和脂质指标（TG、TCHO、LDL-C、HDL-C）分析脂质积累，结合Western blot检测脂代谢关键蛋白（FASN、p-ACC1、CPT1、ATGL、p-AMPKα）。最后通过胰脂肪酶抑制实验验证肽的体外降脂潜力。

其次，本研究再以HepG2细胞为模型，采用350 μM的棕榈酸钠（PANa）处理24小时建立高脂损伤模型。实验组预先以100 μM的LR-7、KA-8或PG-7孵育4小时，再与棕榈酸钠（PANa）共处理。通过CCK-8检测细胞活力，显微镜观察形态变化；试剂盒测定抗氧化酶活性与脂质含量；Western blot分析Nrf2通路（HO-1、NQO1）及脂代谢蛋白表达；油红O染色可视化脂滴积累；并检测胰脂肪酶抑制率。

3. 高脂细胞添加剂

在体外模型中，研究采用棕榈酸钠为游离脂肪酸（FFA）处理HepG2细胞，成功模拟了非酒精性脂肪肝（NAFLD）中的高脂损伤环境，诱导肝细胞的脂质堆积和细胞损伤。

该高脂细胞添加剂（KC001）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。其中，棕榈酸钠可以用来诱导绝大数常见细胞的损伤和炎症。需要说明的是，由于部分肝细胞较为敏感，某些情况下研究人员单独使用棕榈酸（钠）或油酸（钠）进行诱导也能获得理想的实验结果，但在研究代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）时，多数文献更推荐棕榈酸钠与油酸钠联合诱导的技术方案。

4. 细胞实验结果

1）肽显著改善细胞存活与形态（图1） 

棕榈酸钠（PANa）处理导致HepG2细胞存活率降至33.3%（图1b），细胞松散脱落且凋亡增多（图1d-B）。三种肽（100 μM）预处理后，细胞存活率显著回升（图1c），其中LR-7组恢复最明显。形态学显示，肽处理组细胞重新呈现多边形贴壁生长，聚集增多（图1d-C至E），表明肽有效缓解了PANa的细胞毒性。

图1  LR-7、KA-8、PG-7对人肝癌细胞的保护作用

2）激活抗氧化通路缓解氧化损伤（图2） 

棕榈酸钠（PANa）显著抑制CAT、SOD、GSH-Px活性（降幅>20%），并升高MDA 105%（图2a–d）。三种肽均逆转此趋势，尤以LR-7效果最强：CAT与GSH-Px活性提升超100%，MDA恢复至正常水平（图2a,c,d）。分子机制上，LR-7使Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达分别增加111.5%、131.7%和120%（图2e–h），证实其通过激活Nrf2通路增强细胞抗氧化能力。

图2 LR-7、KA-8和PG-7对HepG2细胞抗氧化能力的影响

3）调控脂代谢减少脂质积累（图3） 

油红O染色显示，PANa组脂滴大量积累（图3-B），而LR-7处理组脂滴减少最显著（图3-C）。生化检测表明，PANa升高TG（124.1%）、TCHO（48.4%）和LDL-C（58.3%），降低HDL-C（51.7%）；肽处理逆转这些异常，LR-7在降低TG、TCHO和LDL-C上效果最优。Western blot进一步揭示机制：LR-7下调脂合成蛋白FASN 59.6%，上调脂解蛋白CPT1（134.7%）和ATGL（148.1%），并促进ACC1磷酸化（p-ACC1增加293.7%）以抑制脂生成。此外，LR-7显著激活AMPK磷酸化（p-AMPKα），通过AMPK/ACC/CPT1轴协同调控脂代谢。

图3 LR-7、KA-8和PG-7对脂肪积累的影响

4）抑制胰脂肪酶辅助降脂（图4） 

三种肽均抑制胰脂肪酶活性（图4），其中LR-7的抑制率超过阳性药奥利司他，KA-8与之相当，PG-7稍弱。这表明肽可通过减少膳食脂肪消化吸收，间接降低血脂水平。

图4  LR-7(A)、Ka-8(B)和PG-7(C)对胰腺脂肪酶活性的抑制作用

5. 总结

抗氧化肽是一种广为人知的功能性食品，在健康和疾病中具有多种生物活性。本研究观察了三种从硬骨中提取的多肽LR-7(LALFVPR)、KA-8(KLHDEEVA)和PG-7(PSRILYG)对棕榈酸钠(PANa)诱导的HepG2细胞增殖的影响。结果表明，三种多肽均能显着降低细胞内氧化损伤和脂肪蓄积，并能使PANa所致的血脂异常水平恢复正常。此外，LR-7处理后，细胞内过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和核因子红系相关因子2(NRF2)水平增加了100%以上。Western印迹分析显示，LR-7处理组的脂肪酸合酶(FASN)表达显著降低59.6%，而肉碱棕榈酰转移酶1(Cpt1)和脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的表达分别增加134.7%和148.1%。此外，这些多肽还有效地抑制了胰腺脂肪酶的活性。值得注意的是，LR-7在所有评估参数中表现出了卓越的效果，这可能是因为它具有更强的疏水性。综上所述，LR-7、KA-8和PG-7可以有效地减轻氧化应激，调节脂质代谢，从而保护HepG2细胞免受PANa诱导的损伤和脂质堆积。这项研究表明，这些胶原衍生肽，特别是LR-7，有望成为治疗高脂血症的天然药物。

小编有话说：

本研究通过棕榈酸钠（文中简称PANa，又称SP）诱导HepG2细胞建立高脂模型，系统验证了海鲶鱼骨胶原肽（LR-7、KA-8、PG-7）的降脂与抗氧化机制。细胞处理流程包括：以100 μM肽预处理4小时，后以350 μM PANa刺激24小时；通过CCK-8、生化试剂盒、Western blot及油红O染色多维度评估效果。结果表明，LR-7因富含疏水性氨基酸（亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸），在缓解氧化应激（激活Nrf2通路）、抑制脂合成（下调FASN/p-ACC1）、促进脂解（上调CPT1/ATGL）及抑制胰脂肪酶方面均表现最优。

鲲创品牌的棕榈酸钠（Sodium Palmitate，SP）作为高脂细胞模型的核心诱导剂，其稳定诱导脂毒性表型的能力为抗高脂血症药物筛选提供了可靠平台，与其他品牌相比，具有浓度准确、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶等核心优点。本研究推荐使用高精度棕榈酸钠（KC001），确保实验可重复性。展望未来，源自海洋资源的活性肽（如LR-7）有望开发为天然降脂功能因子，而棕榈酸钠作为标准化工具，将持续助力脂代谢疾病机制研究与药物开发。

参考文献

SONG S, ZHAO W, LIN Q, et al. Peptides from Harpadon nehereus Bone Ameliorate Sodium Palmitate-Induced HepG2 Lipotoxicity by Regulating Oxidative Stress and Lipid Metabolism[J/OL]. marine drugs, 2025, 23(3): 118. DOI:10.3390/md23030118.