Food Frontiers（IF 6.9）：棕榈酸钠/油酸钠高脂复合添加剂处理人肝癌细胞HepG2和人脐静脉内皮细胞HUVECs建立高脂细胞模型

1. 研究背景

随着现代高脂饮食的普及，脂代谢紊乱成为心血管疾病的重要诱因。桃仁作为桃加工副产物，其油脂富含油酸（65.26%）和亚油酸（21.58%），并含有生育酚等抗氧化物质，但对其生物活性的研究相对匮乏。斑马鱼因体型小、繁殖快、与人类脂质运输机制高度保守等优势，成为脂代谢研究的理想模型。载脂蛋白E（ApoE）在胆固醇转运和脂质稳态中起关键作用，其缺失可导致高脂血症。本研究采用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼ApoEa基因，构建脂代谢紊乱模型，并系统探究桃仁油（PKO）调控脂代谢紊乱的作用机制。已有研究表明PKO能降低ApoE^−/−小鼠总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白，并减少动脉粥样硬化斑块面积，但具体分子机制尚不明确，且传统小鼠模型周期长、成本高。因此，利用斑马鱼模型可高效、经济地解析PKO的降脂及抗炎抗氧化功能。

2. 技术路线

本研究首先通过CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼ApoEa基因，获得纯合突变体并进一步与野生型AB斑马鱼杂交得到杂合子（Het ApoEa）。将Het ApoEa斑马鱼幼虫从5天起用高脂饲料（含24%脂肪和4%胆固醇）连续喂养5-6天，成功建立脂代谢紊乱模型。通过油红O染色、BODIPY荧光标记、总胆固醇/甘油三酯检测、HE染色及透射电镜观察脂质积累和肝脏损伤。在此基础上，将PKO掺入高脂饲料给药，评价其对血管脂质堆积和中性粒细胞形成的影响。同时，利用HepG2和HUVECs细胞建立体外高脂、氧化应激和炎症模型，通过油红O染色、ROS探针、ELISA及RNA-seq探究PKO抑制脂质积累、降低氧化应激和炎症的分子机制，最终揭示PKO通过抑制stat1b和pkr表达激活Jak-STAT信号通路。

为验证PKO在细胞水平的降脂作用，研究采用油酸钠（SO）和棕榈酸钠（SP）联合处理人肝癌细胞HepG2和人脐静脉内皮细胞HUVECs，建立高脂细胞模型。MTS实验确认PKO和阳性药辛伐他汀对两种细胞均无毒性后，以480/240 µM的SO/SP比例诱导细胞内脂质蓄积，油红O染色显示该比例使脂质含量最高。PKO处理后显著减少脂滴面积，与斑马鱼模型结果一致。此外，采用H₂O₂诱导氧化应激、TNF-α诱导炎症反应，PKO均能降低ROS水平、恢复细胞活力，并下调TNF-α和IL-1β分泌，表现出抗氧化和抗炎活性。

3. 棕榈酸钠/油酸钠高脂复合添加剂

本文在体外细胞模型中，使用棕榈酸钠/油酸钠高脂复合添加剂处理人肝癌细胞HepG2和人脐静脉内皮细胞HUVECs建立高脂细胞模型，成功诱导HepG2和HUVECs细胞脂肪变性，模拟高脂环境。

该棕榈酸钠/油酸钠高脂复合添加剂（货号KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的油酸（钠）、棕榈酸（钠）相比，具有如下显著优点：

1）该棕榈酸钠/油酸钠高脂复合添加剂为液体溶液，浓度准确，可以直接溶解在细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。

2）该棕榈酸钠/油酸钠高脂复合添加剂的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。

3）该棕榈酸钠/油酸钠高脂复合添加剂低温无析出、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

该棕榈酸钠/油酸钠高脂复合添加剂（货号KC006）有效解决了现有M品牌、S品牌、A品牌中棕榈酸钠、油酸钠在低温、常温下易析出、溶液浑浊等技术问题，现有M品牌、S品牌、A品牌的产品需要在每次使用前将试剂前置于室温或置于2~8℃冰箱过夜溶解，如溶液不澄清，还需要在≤50℃水浴加热，且不能超过3min，高温助溶过程不仅会增加额外的操作步骤、而且会增加外缘污染的可能性。此外，最为关键的是高温助溶过程会影响试剂的稳定性。《化学词典》（顾翼东等，上海辞书出版社，第542页）明确记载了油酸（钠）在常压下高温加热会存在分解的可能性。因此，反复的高温助溶会是实验结果不可靠、不能复现的可能因素之一，需要特别注意。上述技术问题的本质是M品牌、S品牌、A品牌均未采用合理的溶解方法以及合理的原料配比，导致试剂不稳定、易析出、作用浓度不准确。

需要说明的是，该棕榈酸钠/油酸钠高脂复合添加剂（货号KC006）中棕榈酸（钠）可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸（钠）可以用来诱导细胞代谢异常。棕榈酸（钠）和油酸（钠）可以单独使用，也可以联合使用，棕榈酸（钠）和油酸（钠）联合诱导更加符合人体环境，适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

实际使用时，棕榈酸（钠）和油酸（钠）可以采用如下比例，直接加入完全培养基。

油酸（钠）：母液浓度12 mmol/L→作用浓度0.5 mmol/L，稀释了24倍； 

棕榈酸（钠）：母液浓度6 mmol/L→作用浓度0.25 mmol/L，稀释了24倍； 

24份总体积=1份油酸（钠）+1份棕榈酸（钠）+22份完全培养基； 

此时，以1.2 mL为例，油酸（钠）加1.2/24=0.05 mL，棕榈酸（钠）加1.2/24=0.05 mL，其余为完全培养基。以1mL为例，油酸（钠）加1/24=0.0417 mL，棕榈酸（钠）加1.2/24=0.0417 mL，其余为完全培养基。

4. 实验内容

为了深入验证PKO在细胞层面的作用机制，研究首先选取了与脂代谢密切相关的两种细胞：人肝癌细胞HepG2和人脐静脉内皮细胞HUVECs。这两种细胞分别代表肝脏脂质代谢和血管内皮功能的关键靶点。在建立高脂模型前，通过MTS细胞活力实验评估PKO及辛伐他汀的安全性，结果显示PKO在0.5–2.0 mg/mL浓度范围内对两种细胞均未产生明显毒性（图1b），同样辛伐他汀也无抑制效应，这为后续给药浓度提供了安全保障。

图1. PKO抑制高脂肪细胞模型中的脂质堆积。(a)细胞模型图。(b-d)用MTS法检测PKO、Sim和SO/SP的细胞活力。(e，f)油红O染色的HepG2和HUVECs细胞。(G)HepG2和HUVEC的油红O染色计数。

随后，研究人员采用不同比例油酸钠（SO）和棕榈酸钠（SP）的混合液诱导细胞脂肪变性。在预实验中，所有SO/SP比例均未影响细胞活力（图1c,d），但油红O染色结果显示，480/240 µM的SO/SP组合使细胞内脂质积累最为显著，因此被选为最佳诱导浓度。在接下来的实验中，细胞先经SO/SP处理48小时建立高脂模型，再给予不同浓度PKO（0.5、1.0、2.0 mg/mL）或辛伐他汀处理48小时。油红O染色及定量分析表明，高浓度PKO（2.0 mg/mL）能够显著降低HepG2和HUVECs细胞内的脂质面积，效果与辛伐他汀相当（图1e–5g）。这一结果与斑马鱼整体模型中PKO减少血管脂质堆积的现象高度吻合，证实PKO具有跨物种的降脂潜力。

除了脂质积累，氧化应激和炎症也是高脂诱导血管损伤的重要环节。研究进一步建立了H₂O₂诱导的氧化应激模型和TNF-α诱导的炎症模型。在氧化应激模型中，用200µM H₂O₂处理细胞2小时，随后加入PKO孵育48小时。ROS荧光探针（DCFH-DA）检测显示，模型组细胞内ROS水平显著升高，而PKO处理后ROS阳性荧光面积明显减少（图2a），表明PKO具有清除活性氧的能力。同时，在细胞模型中，高脂诱导后抗氧化酶Hmox1的mRNA表达显著下降，而PKO则能上调其表达（图S7），进一步支持PKO的抗氧化作用。在炎症模型方面，用TNF-α（10ng/mL）处理HepG2和HUVECs细胞24小时诱导炎症，然后给予PKO处理。ELISA检测结果显示，模型组TNF-α和IL-1β分泌量显著增加，而PKO处理能够有效降低这两种促炎因子的水平（图2b,c）。值得注意的是，在斑马鱼整体实验中，PKO同样抑制了高脂诱导的中性粒细胞形成，这表明PKO在体内外均能调控炎症反应。综合这些结果，PKO通过多途径同时发挥降脂、抗氧化和抗炎作用：一方面直接减少细胞内脂滴积聚，另一方面降低ROS生成并抑制炎症因子释放，从而保护血管内皮细胞和肝细胞免受高脂损伤。这些细胞层面的机制解析为PKO作为功能性食品原料的开发提供了坚实的实验依据。

图2. PKO抑制细胞模型中的ROS水平和炎性细胞因子。(a-c)诱导HUVECs细胞脂肪变性，然后加入SO/SP(240/120 µM)、Sim(5µM)或PKO(100 µg/mL)，以评价其改善/保护作用。在此条件下，(a)ROS荧光观察和定量。(b)TNF-α检测。(c)IL-1β检测。(d)SO/SP诱导的细胞模型中ROS与炎症的关系。(e)H₂O₂处理2小时后细胞活力测定。(f)在一定浓度下H₂O₂处理2小时后，用微量平板阅读器测定ROS荧光。(g)200微米H₂O₂作用2小时后，用5µM米Sim或100 µg/mL PKO处理48小时后进行细胞存活率测定。(H) H₂O₂作用2小时后HUVEC中TNF-α和IL-1β的水平。(i)用10或20 ng/mL TNF-α处理细胞24 h后，测定5µM Sim或100µg/mL PKO处理48 h后的细胞存活率。

5. 总结

由于当今不健康的饮食习惯，如高脂肪饮食(HD)，人们的身体处于亚健康或不健康状态，其中血脂紊乱是心血管疾病的主要原因。桃仁油(PKO)是桃的副产物，富含油酸和亚油酸，但对其生物学特性的研究较少。斑马鱼是研究脂代谢的良好动物模型。本研究旨在建立ApoEa基因缺陷斑马鱼的脂代谢紊乱模型，研究PKO对脂代谢紊乱的调节作用。根据我们的研究结果，饲喂HD 5天可以建立ApoEa杂合子(Het ApoEa)斑马鱼脂代谢紊乱模型。HET ApoEa斑马鱼饲喂HD 5d后，总胆固醇显著增加，动脉血管内脂质积聚显著增加，肝细胞内脂滴丰富，线粒体损伤。PKO在斑马鱼脂代谢紊乱模型中的作用表明，PKO可抑制HD诱导的脂质蓄积，减少中性粒细胞的形成。在体外高脂、氧化应激和炎症模型的血管(HUVECs)和肝脏(HepG2)细胞中，PKO抑制细胞内脂质堆积，减少活性氧(ROS)的产生，恢复炎症损伤后的细胞活力。RNA-seq分析结果表明，PKO通过抑制STAT1b和PKR的表达而激活JAK-STAT信号通路。我们的研究结果表明，PKO作为一种天然活性产物，在食品开发中具有很好的潜力。

小编有话说：

在细胞实验中，油酸钠（SO）与棕榈酸钠（SP）以480/240 µM比例联合处理48小时，成功诱导HepG2和HUVECs细胞脂肪变性，模拟高脂环境。PKO在0.5–2.0 mg/mL浓度下未显示细胞毒性，并能显著降低脂质蓄积、ROS及促炎因子。材料与方法中细胞处理具体为：SO/SP混合液（KC006，Kunchuang）溶于无血清培养基，与10% FBS的DMEM共同培养，PKO母液由10 mg溶于1 mL FBS配制后稀释至1 mg/mL。高纯度油酸钠与棕榈酸钠作为脂代谢研究的经典诱导剂，为体外高脂模型构建提供了稳定、可重复的基础。该棕榈酸钠/油酸钠高脂复合添加剂（货号KC006）可精准支持脂代谢药物筛选及功能食品功效评价研究，助力心血管疾病防治产品的开发。

参考文献

XIA L, MO Y, DUAN Y, et al. Peach Kernel Oil Modulates Lipid Metabolism Disorder in ApoEa CRISPR/ Cas9 Gene‐Disrupted Zebrafish[J/OL]. Food Frontiers, DOI:10.1002/fft2.70156.