Redox Biology（IF 11.9）：棕榈酸高脂细胞添加剂模拟肥胖相关脂毒性环境处理小鼠TM3 Leydig细胞系

1. 研究背景

肥胖是全球性的公共卫生问题，也是男性不育的重要危险因素。高热量饮食驱动的代谢紊乱通过增加芳香化酶活性、升高雌激素并降低雄激素水平，抑制睾丸间质细胞（Leydig cells）的类固醇合成，同时引发系统性低度炎症和持续性氧化应激。过量的活性氧（ROS）导致睾丸微环境内脂质过氧化、线粒体损伤和DNA断裂，进而损害精子活力、受精能力及基因组完整性。传统干预手段如生活方式调整和药物疗法存在依从性差或副作用多的局限，而天然抗氧化剂成为新热点。该研究基于高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠模型，结合非靶向代谢组学与转录组学分析，系统描绘了睾丸组织在肥胖状态下的代谢特征。

值得注意的是，代谢组学分析揭示，麦角硫因（Ergothioneine，ET）是唯一在HFD喂养过程中含量随时间持续下降的代谢物，提示其作为睾丸内源性氧化应激累积生物标志物及潜在治疗靶点的潜力。ET是一种天然含硫氨基酸，富集于蘑菇等食物，可在高代谢活性且易受氧化应激的组织中蓄积，发挥强效抗氧化作用。本研究进一步在体内、体外及离体人睾丸培养模型中评估了ET补充对肥胖相关睾丸功能障碍的改善作用，揭示了其能恢复类固醇生成和线粒体氧化还原稳态的机制。

2. 技术路线

在技术路线上，研究人员首先构建了短期（9周）和长期（14周）HFD喂养的C57BL/6J小鼠模型，评估生殖损伤；随后对小鼠睾丸组织进行RNA-seq与非靶向代谢组学联合分析，挖掘关键通路与差异代谢物；在此基础上，采用与HFD喂养并行的口服ET（100mg/kg/day）干预8周，验证其保护效果；最后通过体外TM3 Leydig细胞模型和离体人睾丸组织培养进行机制验证与临床转化评估。

在细胞实验层面，研究选用小鼠TM3 Leydig细胞系，以棕榈酸（PA, 20 μM，Xi'an Kunchuang）模拟肥胖相关的脂毒性环境，并通过CCK-8法确定PA和ET的合适浓度（ET预处理浓度0.2 mM和0.8 mM，预处理24 h后再与PA共孵育48 h）。主要检测指标包括：一般细胞内氧化应激水平（DCFH-DA荧光探针）、线粒体膜电位（JC-1和TMRE双方法）、线粒体超氧阴离子（MitoSOX Green）、线粒体形态（MitoTracker Red CMXRos）、类固醇合成关键蛋白（PKA-CREB-StAR信号通路）以及下游产物（孕烯醇酮、睾酮的ELISA检测）。这部分实验为机制阐释提供了直接的细胞学证据。

3. 棕榈酸高脂细胞添加剂

本文在体外细胞模型中，使用棕榈酸高脂细胞添加剂模拟肥胖相关脂毒性环境处理小鼠TM3 Leydig细胞系，成功诱导线粒体ROS过度产生和线粒体膜电位（ΔΨm）去极化，破坏类固醇合成关键信号通路。

该棕榈酸高脂细胞添加剂（货号KC003）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的棕榈酸高脂细胞添加剂、棕榈酸BSA高脂细胞添加剂相比，具有如下显著优点：1）该棕榈酸高脂细胞添加剂为液体溶液，浓度准确，可以直接溶解在细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。2）该棕榈酸高脂细胞添加剂的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。3）该棕榈酸高脂细胞添加剂低温无析出、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

需要说明的是，该棕榈酸高脂复合添加剂（货号KC003）可以用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。针对不同细胞种类及实验目的，本产品所用浓度不同，一般与培养基总体积按比例稀释，建议的终浓度范围为50-500 μmol/L。对于首次使用本产品，建议采用浓度梯度处理细胞，摸索针对特定细胞、达到特定效果的适宜浓度。处理时间上可通过镜下观察细胞状态初步判断，一般24-48小时为宜。

4. 实验内容

细胞层面实验结果显示，ET具有多重保护作用。图中上半部分结果显示，PA处理导致TM3细胞内DCF荧光强度显著升高（相比对照组增加约2.1倍），提示氧化应激水平急剧上升；而ET预处理（尤其是0.8 mM组）则使荧光强度下降至接近对照水平，表明ET能有效清除过量的活性氧。在MitoSOXGreen染色中，PA组线粒体区域呈现明亮的绿色荧光，流式细胞术定量显示其平均荧光强度（MFI）约为对照组的1.8倍，说明线粒体超氧阴离子大量生成；ET处理后这一信号被显著压制，0.8 mM ET组MFI降至对照组的1.1倍，几乎完全恢复。线粒体膜电位的评估通过JC-1和TMRE两种互补方法完成：JC-1染色下，对照组呈现明亮的红色荧光（J-聚集体）而绿色荧光微弱，红/绿比值高；PA组则出现红/绿比值的显著下降（降低约40%），表明ΔΨm去极化；ET预处理有效逆转了这一趋势，在0.8 mM浓度下红/绿比值回升至对照组的90%以上。TMRE流式结果与JC-1一致，PA组荧光强度降低约35%，ET组则恢复至对照组的95%左右。线粒体形态方面，MitoTracker染色显示对照组细胞中线粒体呈细长丝状网络均匀分布，PA处理导致线粒体碎片化、短杆状增多且荧光强度下降，提示线粒体膜电位耗散与结构损伤；ET预处理后线粒体网络得以保留，荧光强度与形态参数均接近正常。在类固醇合成功能上，Western blot结果显示PA显著抑制了PKA、磷酸化CREB（p-CREB）和StAR蛋白的表达，而ET以剂量依赖方式恢复这些蛋白的水平。ELISA数据进一步证实，PA使细胞上清中的孕烯醇酮和睾酮分别下降50%和45%，ET 0.8 mM处理则使两者回升至对照组的85%以上。这些细胞实验共同显示，ET通过恢复线粒体氧化还原稳态和激活PKA-CREB-StAR信号，抑制PA诱导的脂毒性，从而恢复Leydig细胞的类固醇生成功能。

图1. 麦角硫因（ET）可维持高脂饮食所致睾丸损伤中的线粒体完整性与抗氧化能力。（A）睾丸组织中硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）的浓度，用作脂质过氧化的替代标志。（B-C）酶促抗氧化剂的活性，包括超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT），归一化为总蛋白质含量。每组6例。（D）棕榈酸（PA，20μM）和ET (0.2，0.8 mM）处理的TM3细胞的典型流式细胞术直方图和荧光强度的定量分析。DCF荧光反映了细胞内普遍的氧化应激状态。（E）蛋白质印迹分析和相应的线粒体抗氧化酶SOD2和Gpx4的定量。（F）具有代表性的流式细胞术直方图和TMRE荧光定量分析（MFI）。用TMRE作为能斯特指示剂，监测线粒体膜电位（ΔΨm）。（G）在PA和ET干预后，对线粒体结构和生物遗传标记进行Western blot印迹分析，包括COXIV、TOMM20和细胞色素c。（H-M）TM3细胞的典型共聚焦激光扫描显微镜图像：MitoSOX红：线粒体超氧化物歧化（O2·-）的特异性指示剂。JC-1：通过从红色J－聚集体到绿色单体的转变来可视化ΔΨm。Mito-TrackerRedCMXRos：专门标记活跃的线粒体，以验证细胞器的形态和定位。标尺=50μm。

5. 总结

本文采用高脂饮食（HFD）小鼠模型，结合多组学分析、细胞分析和体外人类睾丸培养，揭示长期HFD喂养可逐渐损害精子质量、生精结构和类固醇生成能力。研究结果显示，在睾丸重量不变的情况下，HFD可使精子密度降低21.6%，活动率降低44.9%。转录组和代谢组分析显示，氧化磷酸化和类固醇合成中间体的耗竭受到显著抑制。补充ET(100mg/kg/d）可明显恢复生精上皮结构，增加生精标志物的表达。在功能上，ET通过减少脂质过氧化和恢复抗氧化酶活性来减轻细胞内的氧化负担。ET可增强线粒体稳定性，保护线粒体膜电位（ΔΨm），减少线粒体超氧阴离子（O2·-）的过量产生。机制上，ET重新激活间质细胞中典型的PKA-CREB-STAR信号级联反应，恢复雄激素的生物合成。最后，体外人类睾丸培养证实，ET可减轻氧化应激指标，并使睾酮释放量增加1.4倍。上述发现将进行性ET耗竭确立为肥胖所致睾丸功能障碍的标志，并证明补充ET可恢复类固醇合成和线粒体氧化还原稳态，为抗氧化剂指导的男性不育干预提供了强有力的机制基础。

小编有话说：

在细胞实验部分使用棕榈酸（KC003）以浓度梯度（20 μM为最适）加入TM3细胞培养体系，并设置ET预处理（0.2/0.8 mM，24 h）的干预组。结果显示棕榈酸（PA）通过诱导线粒体ROS过度产生和ΔΨm去极化，破坏类固醇合成关键信号通路，而ET预处理能显著逆转这些损害，恢复睾酮分泌。棕榈酸（PA）作为高脂饮食中饱和脂肪酸的代表，为肥胖相关男性不育研究提供了可靠的体外脂毒性模型工具。后期，该试剂可广泛应用于代谢与生殖领域的细胞机制探索，助力筛选新型抗氧化干预策略。该棕榈酸高脂细胞添加剂具有高纯度、批次稳定等优点，适用于构建脂毒性细胞模型、研究脂肪代谢与氧化应激相关疾病。

参考文献

Li, X., Lin, J., Wu, M. (2026). Ergothioneine rescues obesity-induced testicular dysfunction via dual restoration of steroidogenesis and mitochondrial redox homeostasis. Redox Biology, 91, 104090. https://doi.org/10.1016/j.redox.2026.104090