Environ. Chem. Ecotoxicol.（IF: 8.2）油酸钠诱导HepG2细胞脂肪变性模型模拟MASLD病理状态

1. 研究背景

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种与肥胖、胰岛素抵抗密切相关的慢性肝病，其核心病理特征为肝细胞脂质过度沉积。环境重金属暴露（如砷、镉）已被证实可加速MASLD向炎症阶段（MASH）进展，但锰（Mn）作为必需微量元素，在环境中广泛存在（水源：1–100 μg/L；食物：水稻、坚果等），其肝毒性机制研究相对缺乏。流行病学显示MASLD患者血锰水平升高，而现有锰安全阈值基于健康人群设定，可能低估代谢紊乱个体的敏感性。锰的神经毒性机制较明确，但在脂代谢紊乱背景下如何通过氧化应激、内质网应激（ERS）等途径加剧肝损伤尚不清楚，亟需揭示其与环境暴露相关的分子机制。

2. 技术路线

本研究采用油酸钠诱导的HepG2细胞脂肪变性模型，模拟MASLD病理状态，暴露于环境相关浓度锰（40μM/L）。通过细胞活力检测（CCK-8）、脂质沉积分析（油红O染色、TG/TC测定）、氧化应激指标（ROS、MDA、SOD/CAT活性）及炎症因子检测，结合代谢组学与脂质组学（LC-MS/MS，检测1013种代谢物），并利用RT-qPCR分析脂代谢基因（DGAT1/2、FAS、PNPLA3）和ERS通路基因（IRE1α、CHOP）表达，阐明锰在代谢脆弱细胞中的协同毒性机制。

3. 高脂细胞添加剂

本文在体外细胞模型中，使用油酸钠作为高脂细胞添加剂处理HepG2细胞，模型模拟MASLD病理状态。油酸钠作为游离脂肪酸可以用来诱导多数细胞的代谢异常、脂代谢紊乱。

该高脂细胞添加剂（货号KC005）包括了独立包装的12 mmol/L油酸钠和溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的油酸钠、油酸相比，具有如下显著优点：

1）该油酸钠为液体溶液，浓度准确，可以直接溶解在细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。

2）该油酸钠的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。

3）该油酸钠溶液常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

需要说明的是，由于部分细胞较为敏感，研究人员单独使用棕榈酸（钠）或油酸（钠）进行诱导也能获得理想的实验结果，但在研究代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）时，多数文献更推荐棕榈酸钠与油酸钠联合诱导的技术方案。其中，棕榈酸钠可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸钠可以用来诱导细胞代谢异常，高脂细胞添加剂（货号KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，棕榈酸钠和油酸钠联合诱导更加符合人体环境，适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

4. 细胞实验内容

以HepG2细胞为模型，分为四组：对照组、单锰组（40μM Mn）、单油酸钠组（200μM OA，模拟单纯性脂肪变性）、联合组（OA+Mn）。通过CCK-8验证协同毒性（图1C）；油红O染色与TG检测显示联合组脂滴积累加剧（图3A-B）；流式细胞术（DCFH-DA探针）与MDA检测证实联合组ROS升高180%（图2B-D）；脂质组学揭示毒性脂质（DAG、FFA、LPC）显著积累（图4F）；qPCR显示联合组ERS通路基因（IRE1α、CHOP）表达上调250%，且DGAT1/2抑制60–70%（图3G-H），驱动脂毒性。

1. 锰与油酸钠协同诱导细胞损伤

尽管单锰（≤80 μM）或单油酸钠（≤500 μM）对HepG2细胞活力无显著影响（图1A-B），但联合暴露（OA+Mn）导致细胞存活率显著下降（图1C）。两因素方差分析（ANOVA）显示交互作用极显著（p=0.0031），证实锰在脂质蓄积背景下转化为毒性催化剂。

图1  不同浓度锰、油酸钠对HepG2细胞活力的影响

2. 氧化应激与抗氧化系统失衡

联合组ROS水平升高180%（图2C），脂质过氧化产物MDA增加210%（图2D），且抗氧化酶活性紊乱：SOD活性升高而CAT活性降低（图2E-F）。基因层面，核因子Nrf2（抗氧化调节枢纽）表达受抑，SOD mRNA上调但CAT mRNA下调（图2G-I），提示锰破坏OA诱导细胞的氧化还原稳态。

图2  锰对油酸钠诱导的人肝癌细胞氧化应激的影响

3. 脂代谢重编程与毒性脂质累积

油红O染色直观显示联合组脂滴数量与体积显著增加（图3A），TG含量较单OA组升高2.1倍（图3B）。脂质组学热图进一步揭示关键变化： 

• 毒性脂质爆发性积累：DAG（+230%）、FFA（+195%）、溶血磷脂LPC18:3（+170%）等显著上调； 
• 保护性脂代谢途径抑制：甘油三酯合成关键酶DGAT1/2表达下降60–70%（图3G-H），迫使脂质流向毒性中间产物； 
• 脂代谢基因异常：FAS（脂肪酸合成酶）与PNPLA3（脂解酶）上调，而脂肪酸氧化调控因子PPARα下调（图3D-F），形成“合成增加-氧化减少”的恶性循环。

图3  锰对油酸钠诱导的脂肪变性HepG2细胞脂质蓄积的促进作用

4.内质网应激与炎症级联激活

毒性脂质堆积触发ERS通路：联合组IRE1α与CHOP mRNA表达激增250%（驱动ERS-凋亡轴。伴随ERS，炎症因子IL-6、IL-8释放增加200%和180%，从单纯脂肪变性向炎症性肝损伤进展。

5. 总结

锰（Mn）毒性阈值是为健康人群建立的，但患有代谢障碍的个人可能表现出更高的脆弱性。这项研究调查了与环境相关的锰浓度是否通过脂毒机制加剧了从单纯性脂肪变性到脂肪性肝炎的进展。采用40μM/L锰对油酸钠诱导的人肝癌细胞系进行细胞毒性实验，并结合代谢组学和脂质组学方法进行研究。虽然单独使用锰和油酸钠都不会造成明显的细胞损伤，但它们的组合会引发显著的脂毒性。尽管反常地抑制DGAT1/2的表达(减少60%-70%)，但与OA联合暴露的MN显著加速了脂质的积累(甘油三酯增加了2.1倍)。甘油三酯合成的这种中断将脂类重新引导到有毒的中间体：二酰甘油(增加230%)和游离脂肪酸(增加195%)，同时溶血磷脂过度产生(LPC18：3增加170%)。脂毒物质的积累导致氧化应激(180%ROS增加，210%丙二醛增加)，激活IRE1α-CHOP内质网应激途径(250%增加)，并触发炎症级联反应(200%IL-6,180%IL-8增加)。这些发现展示了一种新的范式，其中锰作为一种环境调节剂，促进了从单纯性脂肪变性到炎症性肝损伤的进展，其特征是脂毒性、内质网应激和代谢受损细胞中炎症标志物的升高。这种将亚毒性暴露转化为有效的脂毒性催化剂的做法，突显了为代谢脆弱人群制定疾病特定环境暴露阈值的迫切需要。

小编有话说：

本研究通过油酸钠成功构建HepG2细胞脂肪变性模型：以200 μM OA处理24小时，诱导细胞内TG累积与脂滴形成（图3A-B），模拟MASLD早期病理。联合锰暴露（40 μM，24小时）后，采用CCK-8、油红O染色、流式ROS检测、生化试剂盒（TG/MDA/SOD等）及多组学分析，系统揭示锰通过抑制DGAT介导的甘油三酯合成、转向毒性脂质生成，进而激活ERS-氧化应激-炎症网络的机制。实验全程设BSA溶剂对照，严格遵循三重复原则，数据经两因素ANOVA与Tukey检验验证交互作用显著性。

油酸钠作为高效肝细胞脂毒性诱导剂，在本研究中精准模拟代谢应激状态，为环境毒理与脂代谢研究提供可靠工具。鲲创品牌的油酸钠（产品编号KC005）具有高纯度、高精度、无需加热助溶等优点，适用于类器官、原代肝细胞及HepG2等多种模型，助力脂肪肝、糖尿病等代谢性疾病机制的深度解析。未来可结合该试剂拓展锰等环境因子在器官芯片、多组学整合分析中的应用，推动代谢脆弱人群的精准暴露风险评估。

参考文献

LIU L, NIU Y, GUO Z, et al. Environmental manganese exposure accelerates metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease by lipotoxic endoplasmic reticulum stress[J/OL]. Environmental Chemistry and Ecotoxicology, 2025, 7: 2459-2469. DOI:10.1016/j.enceco.2025.10.014.