EMBO J(IF/8.3):棕榈酸钠模拟高脂肥胖环境研究骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)对脂肪细胞(3T3-L1)分化的影响

作为高脂细胞模型的金标准添加剂,高纯度棕榈酸(钠)可精准模拟饮食诱导的代谢应激。本产品具有低内毒素、浓度准确、常温低温无析出等优点,适用于巨噬细胞极化、脂毒性及胰岛素抵抗研究,助力探索肥胖机制与药物靶点。

棕榈酸(钠)作为高脂微环境的核心模拟剂,在本研究中成功诱导巨噬细胞EP3下调及代谢紊乱,其作用机制涉及PPARγ/NF-κB通路。通过体外细胞共培养体系,采用棕榈酸(钠)不仅重现了肥胖相关的炎症反应,还为EP3-SPARC轴的机制解析提供关键实验基础。细胞培养技术的严谨性(如试剂浓度、处理时间标准化)确保了数据的可重复性,而蛋白质组学与表观遗传分析的结合,则深化了对巨噬细胞-脂肪细胞互作的理解。


1. 前言

肥胖伴随脂肪组织慢性低度炎症,其中巨噬细胞浸润是关键驱动因素。脂肪组织巨噬细胞(ATMs)通过旁分泌信号调控脂肪重塑(如脂肪生成、纤维化),但其机制尚未明确。前列腺素E2PGE2)主要由巨噬细胞产生,通过其受体(如EP3)参与代谢调控。既往研究发现,全身性EP3缺失加剧肥胖,但巨噬细胞特异性EP3的作用及其在肥胖中的调控网络仍不清楚。本研究聚焦巨噬细胞EP3受体在饮食诱导肥胖(DIO)中的作用,结合临床样本(肥胖患者)与动物模型(高脂饮食小鼠),探索EP3下游信号如何通过调控抗脂肪生成因子SPARC(一种抗脂肪生成的细胞外基质蛋白)影响代谢稳态。

首先通过人群和小鼠模型验证EP3ATMs中的表达变化,通过单细胞测序发现肥胖患者ATMsEP3下调;继而构建巨噬细胞特异性EP3敲除(EP3f/f LysMCre)及过表达(Rosa-EP3α/LysMCre)小鼠,结合高脂饮食模型,结合体外共培养、蛋白质组学、表观遗传分析及药理学干预,揭示EP3-SPARC轴的作用及其上游信号通路。

在细胞实验方面,研究以骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)与3T3-L1前脂肪细胞为主要模型,通过棕榈酸处理模拟肥胖环境,利用EP3激动剂(subprostone)与抑制剂(L-798106)调控受体活性,并通过共培养系统评估巨噬细胞对脂肪细胞分化的影响。实验内容包括SPARC表达与分泌检测、DNA甲基化状态分析、以及PKA/Sp1/Dnmt1/3a信号通路的验证。

2. 高脂细胞添加剂

文中采用棕榈酸钠(PA)作为高脂细胞添加剂(货号KC002Kunchuang Biotechnology)模拟高脂肥胖环境研究骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)对脂肪细胞(3T3-L1)分化的影响。

该试剂(KC002)包括了独立包装的10mmol/L棕榈酸钠和溶剂对照,试剂为无菌液体,能够直接使用,具备溶剂无毒、常温无析出,冻融无析出,无需加热助溶等优点,显著减少操作步骤,提升实验的稳定性。其中,棕榈酸钠可以用来诱导细胞损伤和炎症。

3.细胞处理及部分实验结果

体外实验以骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)为核心。首先,建立共培养系统,BMDMs3T3-L1前脂肪细胞共培养,用EP3激动剂(Sulprostone)或抑制剂(L-798106)处理,检测3T3-L1分化标志物(Fabp4PparγC/EBPα)及油红O染色。其次,利用棕榈酸钠模拟高脂环境:PA处理BMDMs,分析EP3表达及SPARC分泌。最后,研究表观调控机制:通过甲基化抑制剂(Azacitidine)、转录因子沉默(Sp1/Dnmt1/3a)验证EP3-SPARC通路。

1)巨噬细胞EP3调控脂肪生成的体外证据

研究通过BMDM3T3-L1前脂肪细胞共培养模型,揭示巨噬细胞EP3对脂肪分化的抑制作用。如图1G-H所示,EP3激动剂Sulprostone预处理的BMDMs显著减少3T3-L1细胞的脂滴积累(油红O染色强度降低60%P<0.0001),而EP3抑制剂L-798106则促进分化(脂滴增加50%)。分子层面(图1I-M),Sulprostone3T3-L1细胞的脂肪生成标志物(Fabp4PparγC/EBPαmRNA和蛋白表达均下调,而抑制剂组上调。这一效应依赖于EP3,因为在EP3-/-BMDMs或抑制剂存在时,Sulprostone的抑制作用消失,证实巨噬细胞PGE2-EP3轴通过旁分泌信号抑制脂肪生成。

2)棕榈酸钠诱导EP3下调及SPARC分泌抑制

为模拟高脂环境,研究用棕榈酸钠处理BMDMs,发现PA显著降低EP3及其亚型(EP3α/β/γ)表达(图1E),且通过PPARγ/NF-κB通路实现。通过4D蛋白质组学分析PA处理的WTEP3-/-BMDMs分泌蛋白(图2A),鉴定出51个下调蛋白,其中细胞外基质结构成分(如SPARC)富集(图2C)。如图2D-F所示,EP3缺失使SPARC蛋白在细胞及上清中表达降低70%P<0.001),而EP3激动剂可逆转此效应(图2H-I)。值得注意的是,SPARC在巨噬细胞的表达虽低于脂肪细胞,但其分泌受EP3α亚型特异性调控(图2J-K):仅沉默EP3α(而非EP3β/γ)显著降低SPARC表达。

3EP3-SPARC通路的表观遗传机制

EP3缺失通过DNA甲基化抑制SPARC转录。EP3-/-BMDMsSparc启动子甲基化水平升高2倍。机制上,EP3缺失上调DNA甲基转移酶Dnmt1/Dnmt3a,而甲基化抑制剂AzacitidineDnmt1/3a基因沉默均可恢复SPARC表达。进一步研究发现,EP3通过PKA/Sp1通路调控Dnmt1/3aEP3激动剂抑制Sp1磷酸化降低其与Dnmt1/3a启动子的结合,而Sp1沉默或抑制剂(MithramycinA)可阻断EP3缺失对Dnmt1/3a的诱导作用。最终,Dnmt1/3a沉默完全逆转EP3-/-BMDMs的促脂肪生成表型。

4)巨噬细胞-脂肪细胞互作的功能验证

SPARC作为EP3下游效应分子,作者在基因干预实验中明确其必要性。EP3α过表达巨噬细胞(Rosa-EP3α/LysMCre)的SPARC表达升高(图2L-N),可抑制3T3-L1分化(图2O-P);但SPARC基因沉默后,该保护作用消失(图2Q-T)。在动物模型中,巨噬细胞特异性SPARC敲除同样抵消了EP3过表达的抗肥胖效应,证实SPARCEP3调控脂肪生成的核心介质。


抑制巨噬细胞EP3促进脂肪生成

2  EP3缺乏通过减少巨噬细胞分泌SPARC促进脂肪细胞分化


4.总结

巨噬细胞是参与肥胖引发的脂肪组织慢性低度炎症的主要免疫细胞。前列腺素E2(PGE2)主要由巨噬细胞产生,可调节脂肪组织重塑,但其内在机制尚不完全清楚。本研究观察到PGE2受体亚型3(EP3)在高脂饮食(HFD)喂养的小鼠和肥胖症患者的脂肪组织巨噬细胞中显著下调。巨噬细胞特异性的EP3基因缺失加剧了高脂饮食诱导的脂肪膨胀,而巨噬细胞中EP3α亚型的过表达减轻了肥胖表型。此外,EP3缺乏抑制了巨噬细胞分泌抗成脂基质细胞蛋白SPARC。巨噬细胞中SPARC的缺失消除了EP3过表达对饮食诱导的肥胖的保护作用。机制上,EP3的激活通过PKA-Sp1-Dnmt1/3a信号级联抑制巨噬细胞DNA甲基化,从而促进SPARC的表达。最后,EP3激动剂治疗改善了HFD诱导的小鼠肥胖。因此,EP3通过促进巨噬细胞释放SPARC抑制脂肪生成,为食源性肥胖提供了新的治疗靶点。


小编有话说:

棕榈酸(钠)作为高脂微环境的核心模拟剂,在本研究中成功诱导巨噬细胞EP3下调及代谢紊乱,其作用机制涉及PPARγ/NF-κB通路。通过体外细胞共培养体系,采用棕榈酸(钠)不仅重现了肥胖相关的炎症反应,还为EP3-SPARC轴的机制解析提供关键实验基础。细胞培养技术的严谨性(如试剂浓度、处理时间标准化)确保了数据的可重复性,而蛋白质组学与表观遗传分析的结合,则深化了对巨噬细胞-脂肪细胞互作的理解。

作为高脂细胞模型的金标准添加剂,高纯度棕榈酸(钠)可精准模拟饮食诱导的代谢应激。本产品具有低内毒素、浓度准确、常温低温无析出等优点,适用于巨噬细胞极化、脂毒性及胰岛素抵抗研究,助力探索肥胖机制与药物靶点。


参考文献

Shang Wenlong, et al. Deletion of EP3 prostaglandin receptor in murine macrophages aggravates diet-induced obesity by suppressing SPARC. The EMBO Journal. 2025 Sep;44(18):4962-4983. doi: 10.1038/s44318-025-00508-y.

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