棕榈酸模拟体内高脂环境诱导小鼠精原细胞损伤引发氧化应激、炎症及细胞凋亡

1. 研究背景

在全球范围内，男性生殖健康面临日益严峻的挑战，其中精子质量下降与环境及生活方式因素密切相关。高脂饮食作为常见的不良饮食模式，可诱导全身代谢紊乱，并通过氧化应激等途径损害睾丸功能。与此同时，以黑碳（BC）为核心成分的大气细颗粒物PM2.5，因其微小粒径和强吸附性，可穿透生物屏障并在睾丸组织蓄积，单独暴露即能引发氧化应激、炎症及细胞凋亡。现实中，城市化与工业化进程常伴随着高脂饮食的普及，个体往往同时暴露于这两种威胁之下，其生殖系统可能遭受内源性代谢紊乱与外源性环境污染物的双重打击。然而，现有研究多聚焦于单一因素的毒性效应，关于棕榈酸（PA）与BC联合暴露对精子发生关键起始环节——精原细胞的损伤作用及其内在分子机制，尤其是NRF2通路在其中扮演的角色，尚缺乏系统深入的探讨，这正是本研究拟解决的核心科学问题。

2. 技术路线

为深入探究PA与BC联合暴露对精原细胞的损伤机制及NRF2通路的作用，本研究制定了清晰的技术路线：首先以小鼠精原细胞系GC-1为体外模型，通过CCK-8法测定细胞活力并计算半数抑制浓度，评估PA与BC单独及联合作用的细胞毒性及相互作用性质（协同、相加或拮抗）。在此基础上，进一步利用RT-qPCR技术检测氧化应激、铁死亡及自噬相关关键基因的mRNA表达水平，通过比色法测定氧化损伤标志物MDA和抗氧化剂GSH的含量，并采用Western blot验证核心转录因子NRF2的蛋白表达变化，从而系统阐明NRF2信号通路在联合暴露诱导细胞损伤中的调控作用。

基于上述路线，本研究开展了一系列细胞实验。将GC-1细胞分为对照组、PA单独处理组、BC单独处理组以及PA与BC联合处理组，处理24小时后进行观测。实验内容主要包括：通过CCK-8检测和形态学观察评估细胞活力和形态变化；通过RT-qPCR检测Nfe2l2、Keap1、Hmox1、Nqo1、Gclc、Cat、Gpx4、Lc3b及Sqstm1等基因的转录水平；通过生化法测定细胞内MDA和GSH水平以评估氧化还原状态；最后通过Western blot检测NRF2蛋白的表达量，从而在细胞活力、形态、基因表达和蛋白水平等多个层面，系统揭示了PA与BC联合暴露对精原细胞的协同毒性效应及其潜在的分子机制。

3. 高脂细胞添加剂

本文在体外细胞模型中，使用棕榈酸作为高脂细胞添加剂处理小鼠精原细胞系GC-1，建立细胞损伤模型以模拟体内高脂环境，分析其对精原细胞活力、增殖及关键调控基因表达的影响。

该高脂细胞添加剂（货号KC003）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸和溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的棕榈酸相比，具有如下显著优点：

1）该试剂为液体溶液，浓度准确，可以直接溶解在细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。

2）该试剂的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。

3）该试剂常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

需要说明的是，棕榈酸适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。实际使用时，棕榈酸可以采用如下比例，直接加入完全培养基。

棕榈酸：母液浓度6 mM→作用浓度0.30 mM，稀释了20倍； 

20份总体积=1份棕榈酸+19份完全培养基； 

此时，以1.2 mL为例，棕榈酸加1.2/20=0.06 mL，其余为完全培养基。以1 mL为例，棕榈酸加1/20=0.05 mL，其余为完全培养基。

4. 细胞实验内容

4.1. 细胞活力

实验选用生长状态良好、处于对数生长期的精原细胞GC-1。经消化、离心、重悬及计数后，用新鲜培养基将细胞悬液稀释至工作浓度。待细胞贴壁后，浓度组分别设置为PA组（200、300、400、500、600、800 μmol/L）、BC组（50、100、200、300、400、500、600、700、800、1000 μg/mL），每个浓度设置6个平行复孔，并同时设置阴性对照组（不加PA和BC，含完全培养基和细胞）和空白对照组（仅含完全培养基），置于37℃、5% CO₂培养箱中继续培养24h。

CCK-8检测步骤为：每孔加入10μL CCK-8试剂及90μL完全培养基（1：9），于培养箱中继续孵育30min后，立即使用酶标仪在450nm波长下读取各孔的光密度（OD）值。按照细胞活力=(OD实验孔－OD对照孔）/(OD空白孔－OD对照孔）×100%，计算不同浓度下的细胞活力和半数抑制浓度（IC50）值。

4.2. 联合暴露

待细胞贴壁后，设置浓度组分别为PA组（200、300、400、500 μmol/L）、BC组（400、500、600、800 μg/mL）、联用组（20、40、80、160 μmol/L PA与35、70、140、280 μmol/L BC按照1∶1的体积两两混合，共16组），每个浓度组设置6个平行复孔，并同时设置阴性对照组（不加PA和BC，含完全培养基和细胞）和空白对照组（仅含完全培养基），置于37℃、5% CO₂培养箱中继续培养24h。

4.3. 结果分析

在细胞实验中，研究评估了棕榈酸（PA）与黑碳（BC）对小鼠精原细胞GC-1的协同毒性。如图1所示，细胞活力检测显示，PA和BC单独作用均能剂量依赖性地抑制细胞增殖，其IC50值分别为320 μmol/L和560 μg/mL。联合暴露时，使细胞活力下降50%所需的浓度显著低于单独暴露组，且计算得到的联合指数（CI）均小于1，证实两者存在协同抑制作用。细胞形态学观察进一步印证了这种协同损伤：PA单独处理引起脂滴积累和空泡化，BC单独暴露导致颗粒附着和细胞皱缩，而联合组则同时出现黑色颗粒沉积与脂滴空泡，细胞皱缩脱落更为严重。分子机制研究表明，暴露激活了NRF2抗氧化应激通路，如图所示，核心转录因子Nfe2l2的mRNA及其蛋白表达上调，而Keap1表达下降。下游抗氧化基因（Hmox1,Cat,Nqo1,Gclc）、铁死亡抑制基因Gpx4以及自噬标志物Lc3b和Sqstm1的mRNA表达也发生显著变化。然而，强烈的氧化损伤依然发生，表现为脂质过氧化产物MDA含量显著升高，而抗氧化剂GSH含量显著降低。这些结果表明，PA与BC联合暴露通过协同作用引发严重氧化应激，尽管激活了NRF2通路及其下游防御网络，但仍导致精原细胞功能受损。

图1  PA和BC对精原细胞GC-1增殖的抑制作用

5. 总结

关于棕榈酸的实验内容表明，其作为高脂环境模拟物，能有效诱导精原细胞GC-1产生氧化应激，当与黑碳联合时，两者表现出显著的协同毒性，强烈抑制细胞增殖并引发严重形态学损伤。在细胞处理上，研究采用了精密的浓度梯度设计（基于IC50）和联合暴露方案，通过24小时染毒，系统评估了从细胞活力、形态到分子表达的多层次效应。实验证实，这种处理成功地激活了细胞的NRF2防御通路，并引发了氧化应激、铁死亡和自噬相关基因的广泛变化，但最终仍导致氧化损伤标志物积累和抗氧化储备耗竭，阐明了NRF2通路在联合暴露损伤中的核心参与机制。本研究深入揭示了环境与代谢因素协同损害男性生殖健康的细胞分子机制，凸显了高质量、可重复的细胞模型在毒理学研究中的基石作用。

小编有话说：

棕榈酸作为高脂细胞添加剂，是构建体外脂毒性模型的理想工具，能够稳定诱导细胞脂代谢紊乱与氧化应激。推荐使用高品质棕榈酸试剂（KC003），结合NRF2通路特异性调节剂，可深入揭示联合暴露的分子机制，为男性生殖保护策略的研发提供关键工具。作为高脂细胞添加剂棕榈酸（PA）的供应商，我们致力于为科研工作者提供高纯度、稳定可靠的产品，以精准模拟体内代谢应激状态。该研究展示了PA在揭示环境－生活方式交互毒性中的关键价值，期待科研人员以后能在生殖毒理学、代谢疾病及环境健康风险评估领域取得更多突破性发现。

参考文献

张远，韩雪，石金珂，吴德生，等。 NRF2通路在黑碳与棕榈酸联合暴露损伤精原细胞中的作用机制研究[J]. 中国比较医学杂志, 2026, 36(3)