使用棕榈酸溶液、棕榈酸钠溶液诱导RAOEC（大鼠主动脉内皮细胞）、HUVEC（人脐静脉内皮细胞）、H9C2（大鼠心肌细胞系）、原代乳鼠心肌细胞、骨骼肌细胞、胰岛细胞、成骨细胞、原代MSC（间充质干细胞）等细胞损伤模型及检测CCK8、损伤指标的经验分享与交流

为使大家实验顺利进行，结合高脂试剂使用者在实验期间遇到的问题和反馈，小编在这里与大家分享一下细胞损伤模型建立和指标检测的经验。

肥胖是高血压、糖尿病和心血管疾病的重要危险因素。目前用来研究高脂环境造成损伤的细胞模型，大致有RAOEC（大鼠主动脉内皮细胞）、HUVEC（人脐静脉内皮细胞）、H9C2（大鼠心肌细胞系）、原代乳鼠心肌细胞、骨骼肌细胞、胰岛细胞、成骨细胞、原代MSC（间充质干细胞）等。

棕榈酸（PA）、棕榈酸钠都可以用来建立上述细胞的损伤模型。模型建立的第一步是做梯度浓度实验（见鲲创微信公众号：基于高脂细胞添加剂的高脂细胞模型建立方法和步骤）确立成功诱导细胞损伤的浓度和孵育时间。然后采用摸索好的高脂试剂进行正式试验，下面以棕榈酸诱导MSC高脂损伤为例，进行经验分享。

1、用棕榈酸（PA）处理MSC进行CCK8实验检测细胞活性

一般做CCK8实验推荐用96孔板培养细胞，好处是每组N值足够大，但是这需要一个精准的8通道移液器和实验者稳定熟练的操作技术。

（1）96孔板培养细胞做CCK8实验缺点如下：

• 实验室没有8通道移液器的话，使用单通道移液器给96孔板加CCK8工作液会非常耗时，因为每个孔都要弃掉培养基，用1X PBS洗两遍，再加入配好的CCK8工作液，这个过程步骤比较多。第一个孔和最后一个孔的时间差比较大，有的甚至需要30分钟以上。那么各个孔的CCK8工作液孵育时间是不等的，时间差严重影响实验结果。所以，这种方法不推荐。
• 8通道移液器每次处理8个孔，比单通道移液器处理96孔板时间上快了8倍，组与组之间的时间差不大，推荐使用。但是8通道移液器不准或有些通道插吸头时松动的话，会导致细胞种不匀、加入的培养基和CCK8工作液体积不一致，从而导致实验偏差。

（2）推荐实验新手使用24或12孔板培养细胞做CCK8实验，优点如下：

• 孔数较少，易于缩短孔与孔之间的时间差。因为CCK8工作液的孵育时间长短严重影响OD值。
• 不需要8通道移液器（有点贵）。
• 每组N值也有保证。一般实验分组数为2-4组，以4组为例，24孔板每组N为6；12孔板的每组N为3。如果有趋势无差异，重复实验即可。
• 新手友好。实验新手操作不熟练，使用96孔培养细胞做实验，更是问题百出。使用24/12孔板，孔数相对较少，易操作的同时大大缩短组与组的给药时间，利于实验结果的有效性和稳定性。

接下来，以使用12孔板培养MSC做CCK8实验为例，实验流程分享如下：

                                                         图1：细胞分组示意图

• 每个孔种上密度相等的细胞后，培养至细胞长满再给PA。
• 因为MSC比较耐受高脂环境，一般PA：500uM/mL，48h（具体实验还可以对浓度和给药时间进行优化）可以诱导细胞损伤。当PA组细胞状态变差，有细胞死亡脱落，整体细胞密度相较于对照组变低时，可以进行CCK8实验。
• CCK8试剂和细胞完全培养基按1:9配制，即CCK8工作液。这里说的完全培养基（含10% FBS、1% 双抗），是指细胞正常培养时用的培养基，例如MSC培养用aMEM/F12 DMEM,H9C2培养用高糖DMEM。
• 加入CCK8工作液前，弃掉培养基，用1X PBS 洗两遍，然后每个孔加入500uL CCK8工作液。加好CCK8工作液的12孔板放入37度孵箱，2h。
• 使用酶标仪，选择12孔板模式，测吸光度（OD:450）。

2、用棕榈酸（PA）/棕榈酸钠处理MSC 收集蛋白做凋亡指标

目前文献报道，棕榈酸、棕榈酸钠诱导的细胞死亡类型为凋亡，WB一般检测凋亡指标Cleaved caspase3的蛋白水平。

由于WB检测Cleaved caspase3需要较大的细胞蛋白量，所以至少要使用6cm培养皿培养细胞，10cm皿更好。也要待细胞长满后，给PA，因为做损伤实验，细胞不满的话，损伤组后期收集的细胞蛋白会相对少，不利于WB实验。上面提及的梯度浓度实验，细胞同样需要长满后给高脂处理。下图为检测某种药X是否可以改善棕榈酸（PA：500uM/mL，48h）诱导的损伤实验。

                                                 图2：6cm皿培养细胞分组示意图

Cleaved caspase3 在细胞损伤程度较轻时比较难检测，所以要等到损伤组细胞密度降低30-40%时，再收集蛋白，就可以很好的检测出Cleaved caspase3。为了大家比较直观的分辨细胞损伤程度，这里放了一张对比图，如下：

                                          图3：左图为对照组细胞白光图，右图为PA组白光图

有的蛋白比较好检测，WB时，蛋白上样量20ug/孔就可以很好的检测出。但是，Cleaved caspase3 做WB时需要更多的蛋白量，根据经验50-100 ug/孔，一抗孵育2天，方可以检测出WB条带。图4显示，第4个孔PA+X组的Cleaved caspase3 蛋白表达低于PA组，说明X可以减轻PA诱导的凋亡。

                                  图4：Cleaved caspase3 WB条带，分子量为17/19 kd

总结：棕榈酸（PA）、棕榈酸钠可以建立细胞损伤模型，鲲创科技欢迎大家交流。