高糖高脂诱导的L02细胞（人源正常肝细胞）糖尿病肝损伤模型的建立方法

1. 引言

2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM），是与代谢紊乱相关的慢性疾病，具有持续高血糖和脂质代谢异常的特点，已然成为一种严重的全球健康负担。T2DM还可以诱发全身多个器官损伤进而导致严重的并发症，例如糖尿病性肾病、视网膜病变、心脑血管疾病和慢性肝损伤等。糖尿病肝损伤（diabetic liver injury,DLI）是一种慢性肝损伤，也是慢性炎症和糖脂代谢紊乱的一种形式，即使没有其他已知条件，持续高水平血糖和血脂也足以驱动DLI的发生。

长期热量和域营养摄入过剩、持续性葡萄糖生成和摄取失衡、脂质转运异常等因素会引发和加剧糖尿病及其并发症进展。然而，在体内条件下，由于饮食因素、内分泌调节以及不同组织之间一系列生理和代谢信号交互影响，很难确定导致DLI的直接因素，因此需要在体外实验中寻找更多直接的证据。高浓度葡萄糖负荷会增加肝细胞中线粒体ROS生成，从而导致肝细胞信号传导的严重失调。棕榈酸（palmitic acid，PA）是血浆中主要的循环饱和脂肪酸，过量PA与多种细胞类型的脂毒性有关。

维生素Ｄ（vitamin D, Vd）是唯一一种可以通过阳光照射合成的脂溶性维生素，又被称为“阳光维生素”。既往研究表明，血液循环中维生素Ｄ水平可能会改变促炎和抑炎细胞因子之间的平衡，进而影响胰岛素功效、脂质代谢以及脂肪和肝脏等组织的结构与功能。Mukhopadhyay等在西孟加拉邦的农村地区进行了一项基于人群的研究发现，与正常组相比，维生素Ｄ缺乏组伴有转氨酶显著性升高，提示维生素Ｄ水平与肝功能密切相关。1,25(OH)₂D₃是维生素Ｄ发挥生物作用的主要形式。

现阶段，对于慢性肝损伤的研究多集中于非酒精性脂肪肝模型，而非直接的糖尿病肝损伤模型；同时，基于细胞层面的机制研究则多聚焦于肝脏功能性细胞，如肝巨噬细胞（Kupffer Cells）、肝星状细胞、肝癌细胞等，而对占据肝脏80％以上的实质性肝细胞的研究还鲜有报道。

基于对国内外已发表文献，着眼于1,25(OH)₂D₃的抗炎功效，本研究欲从体内和体外水平探讨1,25(OH)₂D₃对DLI的潜在作用机制。拟通过高糖高脂饲料喂养联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）来构建SD大鼠糖尿病模型，以期了解糖尿病大鼠血清生化指标改变、肝功能酶学指标改变和肝组织病理结构改变，以及1,25(OH)₂D₃可能存在的潜在治疗作用；同时，以人源正常肝细胞（L02细胞）为载体，观察体外条件下使用PA模拟的糖脂紊乱环境对L02细胞的损伤效应，并明确1,25(OH)₂D₃干预是否可以改善高糖高脂诱导的L02细胞损伤。

2.材料与方法

2.1主要材料

表1：实验所用主要试剂列表

其中，高脂细胞添加剂（棕榈酸、 PA）由西安鲲创科技发展有限公司提供。

2.2主要试剂配置

2.2.1完全培养基

取DMEM低糖型培养基89ｍl，加入15ｍl胎牛血清（FBS），1ml青霉素－链霉素混合液(双抗)，混匀，封口，４°Ｃ保存备用。即，含15%FBS、1%双抗的培养基，称为完全培养基。

2.2.2不同浓度高糖培养基

取完全培养基50ｍl，依次加入50mg、150mg、250mg、350mg D-葡萄糖-水合物，分配配置11.1mmol/L、22.1mmol/L、33.3mmol/L和44.4mmol/L浓度的高糖培养基，并用D-甘露醇调节渗透压，混匀，封口，4℃保存备用。

2.2.3不同浓度高脂培养基

取完全培养基和PA（购买浓度，6mmol/L），按下表中步骤配制不同浓度的PA培养基混合液。建议现用现配，首先计算出本次细胞实验需要多少PA，然后配制相应的PA培养基混合液；不建议一次配制大量的PA培养基工作液4°C存放，因为久放容易失效。

表2：PA培养基混合液配制方法1（论文中所述）

采用现用现配的方法，以六孔板为例，每个孔加入1.5mL培养基，配制以上浓度的PA，步骤如表3。配制完成后，弃掉六孔板原培养基，按编号依次加入1.5mL相应浓度的PA混合液到培养板对应的孔里。

表3：PA培养基混合液配制方法2（推荐）

2.2.4细胞冻存液

取完全培养基７ml，加入２ml FBS，1ml DMSO，混匀，封口，４°C保存备用。也可以购买商品化的细胞冻存液直接使用。

2.3 细胞培养

2.3.1细胞复苏

将一次性吸管、Ｔ25细胞培养瓶、15ml离心管、移液枪等实验用品置于超净工作台中紫外照射30min；15ｍl离心管内加入2 ml完全培养基待用；从-80°Ｃ冰箱取出冻存细胞，迅速放入37°C水浴锅中解冻，待细胞溶解为悬液状，吸取细胞悬液至含2 ml完全培养基的离心管内，轻柔吹打混匀，800-1000 g离心５min，弃上清；加入1ml完全培养基，重悬细胞后，移至Ｔ25细胞培养瓶中，加入4ml完全培养基，轻柔摇晃培养瓶，镜下观察细胞分布均匀后，放置于细胞培养箱，37°Ｃ、５％ＣO_２环境下培养。

2.3.2细胞传代

待细胞融合达到80％－90％（其他细胞融合率可达100% ）时，对细胞进行传代处理。将相关实验耗材、培养基（不打开瓶盖）放进超净工作台紫外照射30 min 进行灭菌处理；从培养箱中取出待传代细胞，弃去旧培养基，1X PBS轻柔清洗细胞２次；加入ｌml胰蛋白酶（可根据相应培养板/皿的大小按比例加入合适体积的胰蛋白酶进行消化细胞），摇晃铺匀，30 s后，镜下观察细胞形态，观察到细胞质回缩，细胞形态变圆、周围变亮时，加入５ml完全培养基终止消化，用吸管轻柔、反复吹打贴壁细胞，制成细胞悬液，移至15ml离心管中，800-1000 g离心５min，弃上清，根据实验用量需要和细胞生长情况，按1:3-1:2进行传代（就是一个Ｔ25细胞培养瓶的细胞，传代至3个或2个Ｔ25细胞培养瓶），轻摇培养瓶，镜下观察细胞分布均匀后，放置于细胞培养箱。

2.3.3细胞冻存

选对数期生长细胞，待细胞融合达70％以上（其他细胞融合率可达100%）时进行传代；步骤同上；离心完成后，弃上清，加入ｌml细胞冻存液，轻柔吹打重悬细胞，按500uL/管移入冻存管内，按以下温度梯度进行冻存：４°Ｃ，30 min；-20°Ｃ，1ｈ；-80°Ｃ过夜（可把冻存管放入冻存盒内，-80°Ｃ过夜），隔天置于液氮罐内长期保存。

2.3.4细胞分组及干预

（１）将L02细胞于不同浓度葡萄糖培养基中分别培养24ｈ、48ｈ和72ｈ：

DMEM培养基葡萄糖浓度分别为5.5mmol/L、11.1mmol/L、22.2mmol/L、33.3mmol/L和44.4mmol/L，其中以5.5mmol/L葡萄糖浓度的培养基为对照组，观察不同葡萄糖浓度和培养时间对L02细胞活力影响。这一步用来确定葡萄糖的合适浓度和给药时间。

• 将L02细胞于葡萄糖浓度33.3mmol/L（上一步梯度浓度实验中确定好的浓度）、不同浓度高脂（high glucose+ palmitic acid, HGPA）培养基中分别培养24ｈ、48ｈ和72ｈ。

HGPA培养基浓度依次为：5.5mmol/L葡萄糖＋0mmol/L PA、33.3mmol/L葡萄糖＋0.1mmol/L PA、33.3mmol/L葡萄糖＋0.2mmol/L PA、33.3mmol/L葡萄糖＋0.4mmol/L PA和33.3mmol/L葡萄糖＋0.6mmol/LPA，其中以5.5mmol/L葡萄糖＋0 mmol/L PA为对照组，观察不同浓度高糖高脂培养基和培养时间对L02细胞活力的影响。这一步用来确定特定高糖高脂试剂诱导L02细胞损伤模型的合适浓度和给药时间。

（3）将L02细胞于含不同浓度1,25(OH)₂D₃培养基中分别培养12ｈ、24ｈ和48ｈ：

①在DMEM低糖型培养基培养的L02细胞中，分别加入不同浓度的1,25（ＯＨ）_２D_３干预12ｈ、24ｈ和48ｈ，其分组为：对照组（Control组）和干预组（VitD组）（1,25(OH)₂D₃浓度分别为1、10、100 nＭ）。这一步确定好合适的1,25(OH)₂D₃浓度和干预时间，以后的实验都采用此条件。

②在HGPA培养的L02细胞中，加入上一步实验确定好的1,25(OH)₂D₃给药浓度，其分组为：对照组（Control组）、高糖高脂组（HGPA组）和干预组（HGPA＋Vit D组）。

以上各组细胞在融合率80-100%时，根据相应实验设计条件进行细胞给药处理。据实验需要收集细胞上清液或弃掉，提取L02细胞RNA或蛋白，每个实验独立重复至少３次。

之后，还需CCK-8检测L02细胞活力，ELISA法检测细胞上清液炎症因子水平，实时荧光定量PCR检测炎症因子等目的基因mRNA表达水平，Western blot(WB)检测炎症因子等蛋白表达水平等，具体细节参见原文。

结论：

（１）33.3mmol/Ｌ葡萄糖联合0.1mmol/Ｌ的PA（鲲创高脂细胞添加剂）刺激L02细胞24ｈ后，可成功诱导L02细胞产生炎症应激，增加促炎因子表达。

（２）10nmol/Ｌ的1,25(OH)₂D₃可显著抑制HGPA诱导L02细胞的炎症损伤。

参考文献

王艳.1,25(OH)2D3基于NF-κB通路改善糖尿病肝损伤的作用机制研究[D].郑州大学[2023-09-12].