1. 前言

肥胖是影响心肌肥大和心力衰竭的独立危险因素，减重可以逆转部分心脏重构。2016年WHO报道，全球有超过19亿成年人(≥18岁)超重，超过6.5亿人肥胖。预计到2030年，将有21.6亿人超重，11.2亿人肥胖。研究显示，交感神经系统过度激活是肥胖的早期改变，表现为全身去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)溢出增加以及心率变异性降低。除了交感神经系统的表现外，肥胖还表现为血脂异常、胰岛素抵抗、脂肪积累等病理生理改变，这些改变是促进心血管疾病发生的危险因素。

单胺氧化酶A(monoamine oxidaseA，MAO-A)是一种定位于线粒体外膜的酶，它通过分解代谢NE等神经胺产生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)。大量的ＲOS生成和随后的氧化应激可能通过靶向线粒体功能来影响心肌细胞的存活和功能，从而促进心血管疾病的发生与发展。虽然MAO-A发挥作用的具体机制尚不清楚，但在几种心脏模型中，已发现MAO-A水平增加对心脏功能有损害作用。基于MAO-A对神经胺的降解作用，MAO-A抑制剂在临床上已用于抑郁症患者的治疗以及作为治疗压力负荷性心力衰竭等心脏病的工具药而被广泛研究。本研究旨在探讨MAO-A对高脂环境培养的心肌细胞脂质沉积的影响及其机制。

2.实验材料

棕榈酸(palmitic acid，PA)（KC004）购自西安鲲创科技有限公司，其中：棕榈酸（钠）具有常温无析出、浓度准确，无需反复加热助溶等优点。利用商品化的细胞用高脂细胞添加剂，母液含有高浓度的游离脂肪酸，由于试剂本身为液态、无菌，能与完全培养基直接互溶用于实验，减少了旧方案使用乙醇、NaOH等助溶剂（助溶剂本身有细胞毒性，混杂了高脂试剂的作用）和溶解时的加热操作，节省了操作，增强了实验的稳定性。

3.原代新生大鼠心肌细胞( neonatal rat cardiomyocyte，NRCM)的分离与培养

40只出生1～3天的SD大鼠由武汉大学动物实验中心提供。将整个心脏无菌取出后，用预冷的PBS洗涤液清洗数次，除去残留的血液和多余的组织。将心脏组织剪成约1cm³的组织碎块并转移至含有Ⅱ型胶原酶和0．25%胰酶的消化液中，在37℃的水浴锅中消化5min，收取上清于装有等体积含有10%胎牛血清的终止液中终止消化。反复重复以上消化步骤，直至心脏组织消化完全。收取的上清11000×g离心10min，弃上清，加入等体积含有10%胎牛血清的培养液，吹打混匀，用0.22μm的细胞滤器过滤后均匀地种在培养皿中，放于37℃、5%CO₂的培养箱中差速贴壁1.5h。吸取上清于离心管中，11000×g离心5min，弃上清。用含有10%胎牛血清的培养液悬浮细胞、计数、均匀地种在6孔板和装有爬片的12孔板中。避光环境下加入Brdu溶液(终浓度为0.1mmol/L)抑制非肌细胞的生长。将孔板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，根据细胞的生长情况定期更换培养液。

4．NRCM/3T3-L1共培养体系的建立、细胞处理与分组

将3T3-L1前脂肪细胞种植在Transwell小室中诱导成熟。简单来说，将3T3-L1前脂肪细胞接种在Transwell小室的上室，密度为5×10⁵个细胞/平方厘米，并在含有添加10%FBS和1%PS的基础培养基中培养。48h后，将基础培养基更换为含有DMEM、10%FBS、1%PS、胰岛素(10μg/ml)、地塞米松(0．25μmol/L)和IBMX(0.5mmol/L)的诱导剂Ⅰ。48h后，将诱导剂Ⅰ更换为含有DMEM、10%FBS、1%PS和胰岛素(10μg/ml)的诱导剂Ⅱ。48h后，再次将诱导剂Ⅱ换成基础培养基，每2天更换1次基础培养基。3T3-L1前脂肪细胞诱导成熟(3T3-L1脂肪细胞)后，将Transwell小室移至种有心肌细胞的孔板上，并加入含有PA(400μmol/L)的培养液孵育18h构建NRCM/3T3-L1共培养体系。接下来，在共培养体系中分别加入含有NE(1μmol/L)、H₂O₂(200μmol/L)和CLG(MAO-A特异性抑制剂，1μmol/L)的培养液孵育，将细胞分为对照组(心肌细胞单独培养)、PA组(心肌细胞与3T3-L1脂肪细胞共培养，并加入PA)、NE组(心肌细胞与3T3-L1脂肪细胞共培养，并加入PA、NE)、H₂O₂组(心肌细胞与3T3-L1脂肪细胞共培养，并加入PA、H₂O₂)、NE+CLG组(心肌细胞与3T3-L1脂肪细胞共培养，并加入PA、NE、CLG)、CLG组(心肌细胞与3T3-L1脂肪细胞共培养，并加入PA、CLG)，48h后收取心肌细胞进行后续的检测。

5．结果

1）原代心肌细胞的鉴定:免疫荧光染色显示，大于95%的细胞为心肌细胞(图1)。

2）3T3-L1共培养体系加PA刺激能诱导心肌细胞肥大表型:与对照组比较，PA组中的心肌细胞面积(14.681±0.481μm2vs19.932±0.220μm2，P＜0.01)明显增大，且心肌细胞肥大标志物ANP的相对mＲNA水平(1.006±0.017vs1.914±0.152，P＜0.01)也明显增加，说明3T3-L1共培养体系加PA能诱导心肌细胞肥大表型(图2)。

3）抑制MAO-A改善心肌细胞内脂质沉积:与对照组比较，PA组心肌细胞的脂滴面积比(0.001±0.001vs0.054±0.002，P＜0.01)增加;与PA组比较，NE和H2O2均明显增加心肌细胞的脂滴面积比(0.054±0.002vs0.106±0.005，P＜0.05;0.054±0.002vs0.092±0.002，P＜0.01);与NE组比较，NE+CLG组心肌细胞的脂滴面积比(0.106±0.005vs0.072±0.001，P＜0.01)明显减少，说明抑制MAO-A的相对蛋白水平可部分减少心肌细胞内的脂质沉积(图5)。

6.讨论

本研究使用3T3-L1脂肪细胞与原代心肌细胞在含有PA的培养基中共培养来模拟肥胖大鼠心肌细胞脂肪浸润的内环境。通过在共培养体系中加入NE和H₂O₂来探索MAO-A对高脂培养的心肌细胞内脂质沉积的影响及机制。其中，MAO-A相对蛋白水平增加是导致高脂培养的心肌细胞内ROS水平、以及JNK磷酸化水平和脂质沉积增加的重要原因，其机制可能与ROS/JNK信号级联反应激活有关。本研究为肥胖相关心脏损害的体内研究和临床研究提供了新的干预靶点。

小编有话说：

本研究选取出生1～3天的SD大鼠分离出原代心肌细胞后，与3T3-L1脂肪细胞构建NRCM/3T3-L1共培养体系，并加入400μmol/L棕榈酸（palmitic acid，PA）共培养2-3天，模拟肥胖时心肌细胞所处的内环境，成功诱导出心肌细胞脂质沉积和肥大表型。

参考文献

代地林，吴圆，包明威. MAO-A通过激活ROS/JNK通路加重心肌细胞脂质沉积[J].医学研究杂质, 2023(9).