高脂细胞添加剂溶液不澄清、低温析出、常温浑浊、毒性太强以及50℃~60℃加热助溶等技术问题分析

1. 避免高脂细胞添加剂使用有毒溶剂

诱导高脂细胞模型时，实验人员经常存在配制的高脂溶液析出、难溶解，配制浓度不精准的技术问题。部分技术人员利用油酸及棕榈酸难溶于水，但易溶于乙醇等有机溶剂的特点，采用甲醇、乙醇、氢氧化钠溶液、异丙醇等有机溶剂配制油酸、棕榈酸及其钠盐，部分方法如下图配置方法：

其缺点是上述溶剂本身对细胞就有毒性，而且这些溶剂是否影响试剂本身的性质也不清楚。在细胞实验中，应避免使用有机溶剂配制的高脂试剂，如果使用了少量有毒溶剂，首先应排出是否使用了氢氧化钠、乙醇等有毒溶剂，此外，还应该及时补充空白组和溶剂对照组，确保溶剂对照组对细胞没有较大影响，避免高脂细胞添加剂毒性过强。

2. 避免高脂细胞添加剂出现低温、常温浑浊以及高温助溶操作

部分技术人员基于牛血清白蛋白（BSA）可与自由脂肪酸结合的特点，采用高浓度的BSA溶液配制油酸、棕榈酸及其钠盐，但是由于不了解牛血清白蛋白（BSA）的特性，加入过多的牛血清白蛋白（BSA），导致高脂细胞添加剂溶液不澄清、低温析出、常温浑浊、以及需要50℃~60℃反复加热助溶带来的技术问题，例如：

失败案例1）部分技术人员配置的高脂细胞添加剂在常温或2~8℃短期放置时，会存在溶液不澄清，有效溶质析出的情况，需要60℃加热3~5min助溶。

   失败案例2）部分技术人员配置的高脂细胞添加剂在常温或低温保存时会出现沉淀，需要使用70~80℃金属浴或水浴助溶5-10分钟。

上述高温助溶过程不仅会增加额外的操作步骤、而且会增加外缘污染的可能性。此外，最为关键的是高温助溶过程会影响试剂的稳定性。

《化学词典》（顾翼东等，上海辞书出版社，第542页）明确记载了油酸在常压下高温加热会存在分解的可能性。

  因此，反复的高温助溶会是实验结果不可靠、不能复现的可能因素之一，需要特别注意。

3. 重视高脂细胞添加剂低温、常温浑浊带来的浓度不准确的技术问题

由于配置后出现浑浊、且低温、室温出现沉淀，因此，在0.22uM滤器过滤除菌时，絮状或颗粒状的未溶解软脂酸（或其他脂肪酸、钠盐）被留在过滤器中中，造成滤下去的溶液里软脂酸（或其他脂肪酸、钠盐）的终浓度不准确且无法测量。

此外，由于BSA与棕榈酸钠、油酸钠结合方式不对，导致试剂在诱导损伤或诱导脂滴过程，效果极不稳定，经常出现无法复现的情况。此时并非有效溶解的油酸、棕榈酸及其钠盐，而是油酸、棕榈酸及其钠盐以固体微小颗粒的形式悬浮在溶剂中，当温度降低至40℃以下时，油酸、棕榈酸及其钠盐便会析出，所以有些文献中记载了高脂试剂使用前需要“培养基加热”、“培养基预热”、“55℃-60℃水浴助溶”等步骤。

例如：细胞在37℃孵箱里培养时，配置失败的高脂细胞添加剂会以固体微小颗粒的形式悬浮在培养基中，不能如预期诱导细胞模型，严重耽误实验进度，悬浮状态如下图所示：

4. 如何选择正确的高脂细胞添加剂

1）确保溶剂中不含氢氧化钠、其他碱性试剂及甲醇、乙醇、异丙醇等有机溶剂，确保溶剂无细胞毒性。

2）确保试剂在低温、常温状态下均不产生浑浊、沉淀、析出或絮状物质，确保试剂稳定和浓度准确。

3）确保试剂使用过程中，不需要加热助溶，不需要额外其他操作，可以直接加入到完全培养基中。加入到培养基后，晃动培养板，不存在漂浮状物或浑浊物。

4）确保高脂细胞添加剂已存在大量高文论文的引用和支持

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