油酸高脂试剂盒诱导Hepa1-6（小鼠肝癌细胞）构建肝脏脂肪变性细胞模型
油酸钠：棕榈酸钠为2:1，总浓度为1mmol/L的高脂培养基刺激Hepa1-6细胞24小时，成功建立了肝脏脂肪变性的细胞模型
在众多国内外研究中，NAFLD细胞模型的构建以添加游离脂肪酸（FFAs）最为常见。Gomez-Lechon发现，应用油酸、棕榈酸含量比为2：1的游离脂肪酸混合物刺激肝细胞，引起的细胞毒性和凋亡作用非常微弱，适用于诱导肝脏细胞脂肪变性。本研究中，我们应用油酸钠：棕榈酸钠为2:1，总浓度为1mmol/L的高脂培养基刺激Hepa1-6细胞24小时，成功建立了肝脏脂肪变性的细胞模型。在此基础上发现，FFAs能够诱导Hepa1-6细胞中的miR-27b-3p表达增加，且miR-27b-3p过表达能加重FFAs诱导的脂质沉积和炎症反应。关于miR-27b在脂代谢中的作用，此前已有研究报道。Vickers等人发现，miR-27b是人类和小鼠肝脏中最强大的miRNA脂代谢调控中枢，能够调节多个关键脂质代谢基因的表达。Desrochers等人也发现，miR-27b能够下调肝脏中脂肪酶C的表达，减少丙型肝炎病毒感染期间TG的降解，从而促进肝细胞内脂质沉积。这与研究结果一致。miR-27b在肝脏炎症中的作用报道较少。有研究表明，miR-27b-3p参与慢性肝损伤中巨噬细胞活化的抑制。本研究中，miR-27b-3p对FFAs诱导的炎症反应起促进作用，这可能是由于FFAs刺激导致细胞对炎症的反应性发生改变。
油酸高脂试剂盒诱导Hepa1-6（小鼠肝癌细胞）构建肝脏脂肪变性细胞模型
—汝琳/吉林大学/博士学位论文
1. 前言
非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明确肝损伤因素外，以肝细胞弥漫性脂肪变性为主要特征的慢性肝脏疾病。NAFLD的疾病谱包括非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL），非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），进而可发展为肝硬化，甚至肝细胞癌。
本研究通过检测NAFLD患者血清中miR-27b-3p的表达水平，探究其临床意义，随后在细胞层面揭示了miR-27b-3p对机体脂质代谢及炎症的作用及分子机制，并在高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性小鼠模型中加以验证，以期为NAFLD的治疗提供新的靶标。
在细胞学实验中，我们首先应用游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）在Hepa1-6小鼠肝癌细胞系中构建了肝脏脂肪变性细胞模型，并通过qRT-PCR方法检测细胞内miR-27b-3p的mRNA水平。接下来，分别应用miR-27b-3p模拟物（miR-27b-3p mimic）和抑制剂（miR-27b-3p inhibitor）转染Hepa1-6细胞来上调或抑制细胞内miR-27b-3p的表达，随后用FFAs刺激细胞24小时，通过油红O染色、细胞内甘油三酯（triglyceride，TG）和总胆固醇（total cholesterol，TCHO）测定评估细胞内脂质沉积情况，通过qRT-PCR方法比较细胞中的脂肪酸转运蛋白（fatty acid transportprotein，FATP5）、分化抗原簇36（cluster of differentiation 36，CD36）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）、肉碱棕榈酰转移酶1A（carnitinepalmitoyltransferase1A，CPT1A）、肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactoralpha，TNFα）的mRNA水平表达变化。
2.实验材料
油酸钠棕榈酸钠试剂盒（KC006）购自西安鲲创科技有限公司，其中：棕榈酸钠和油酸钠具有常温无析出、浓度准确，无需加热助溶等特点。利用商品化的细胞用高脂细胞添加剂，母液含有高浓度的游离脂肪酸，由于试剂本身为液态、无菌，能与完全培养基直接互溶用于实验，减少了旧方案使用乙醇、NaOH等助溶剂（助溶剂本身有细胞毒性，混杂了高脂试剂的作用）和溶解时的加热操作，节省了操作，增强了实验的稳定性。
3. 肝脏脂肪变性细胞模型的构建
将Hepa1-6调整为密度1×105/mL的细胞悬液，按照1mL/孔接种于12孔板中，置于37℃、5%二氧化碳的恒温培养箱中培养过夜。当培养板中细胞汇合度达到50%-60%时，弃掉旧培养基，加入含FFAs终浓度为1mmol/L（油酸钠：棕榈酸钠=2:1）的DMEM完全培养基，置于37℃、5%二氧化碳的恒温培养箱中培养24小时以构建肝脏脂肪变性细胞模型。对照组中加入含1%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM完全培养基。
4.实验结果
使用FFAs处理Hepa1-6细胞24小时以构建肝脏脂肪变性细胞模型。油红O染色结果显示，与BSA处理的对照组相比，FFAs组细胞中可见大量红色脂滴（图a）。细胞内脂质测定结果显示，FFAs组细胞内TG、TCHO含量显著高于BSA组（图b，c）。以上结果表明，FFAs诱导的肝脏脂肪变性细胞模型建立成功。随后，通过qRT-PCR方法检测了BSA组和FFAs组细胞内miR-27b-3p的表达水平。结果显示，FFAs组细胞内miR-27b-3p表达水平明显高于BSA组。
图1 FFA诱导肝脏脂肪变性细胞模型的评估
接下来，使用miR-27b-3p inhibitor转染Hepa1-6细胞，24小时后，再用FFA处理细胞24小时。实验分组为：BSA+miRNA inhibitor NC组、BSA+miR-27b-3p inhibitor组、FFA+miRNA inhibitor NC组和FFA+miR-27b-3pinhibitor组。油红O染色和TG、TCHO含量测定结果显示，转染miR-27b-3p inhibitor的Hepa1-6细胞中脂质沉积显著减少。此外，对转染miRNA inhibitor NC的对照组和转染miR-27b-3pinhibitor的实验组提取RNA，进行qRT-PCR检测。结果表明，miR-27b-3p抑制下调了与脂肪酸摄取（CD36,FATP5）、脂肪生成（FASN）和促炎（TNFɑ）相关的基因表达，并上调了与脂肪酸氧化（CPT1A）相关的基因表达。综上所述，miR-27b-3p能够促进肝脏脂肪变性细胞模型脂质沉积和炎症反应，详情请见原文。
5.结论
在众多国内外研究中，NAFLD细胞模型的构建以添加游离脂肪酸（FFAs）最为常见。Gomez-Lechon发现，应用油酸、棕榈酸含量比为2：1的游离脂肪酸混合物刺激肝细胞，引起的细胞毒性和凋亡作用非常微弱，适用于诱导肝脏细胞脂肪变性。本研究中，我们应用油酸钠：棕榈酸钠为2:1，总浓度为1mmol/L的高脂培养基刺激Hepa1-6细胞24小时，成功建立了肝脏脂肪变性的细胞模型。在此基础上发现，FFAs能够诱导Hepa1-6细胞中的miR-27b-3p表达增加，且miR-27b-3p过表达能加重FFAs诱导的脂质沉积和炎症反应。关于miR-27b在脂代谢中的作用，此前已有研究报道。Vickers等人发现，miR-27b是人类和小鼠肝脏中最强大的miRNA脂代谢调控中枢，能够调节多个关键脂质代谢基因的表达。Desrochers等人也发现，miR-27b能够下调肝脏中脂肪酶C的表达，减少丙型肝炎病毒感染期间TG的降解，从而促进肝细胞内脂质沉积。这与研究结果一致。miR-27b在肝脏炎症中的作用报道较少。有研究表明，miR-27b-3p参与慢性肝损伤中巨噬细胞活化的抑制。本研究中，miR-27b-3p对FFAs诱导的炎症反应起促进作用，这可能是由于FFAs刺激导致细胞对炎症的反应性发生改变。
小编有话说：
本研究使用油酸钠+棕榈酸钠联合诱导Hepa1-6细胞的NAFLD模型。发现油酸钠+棕榈酸钠能够诱导Hepa1-6细胞脂质沉积和炎症反应。作者使用油酸钠+棕榈酸钠的按2:1的比例以总浓度为1mmol/L处理细胞24小时，这种方法不是很好计算，且时间偏短。我们一般推荐0.5mmol/L油酸钠+0.25mmol/L棕榈酸钠处理48-72小时，可以达到很好的效果。
参考文献
