油酸钠BSA高脂细胞添加剂诱导原代肝细胞形成脂滴及氧化应激

—王雨朦/西北农林科技大学/中文核心期刊Ei

1. 前言

肝细胞是肝脏中最重要的实质细胞，具有肝脏大部分的功能，被广泛地用于研究非酒精性脂肪肝、肝细胞癌等疾病的发展进程，肝脏中信号通路的转导与功能以及药物的筛选。为了模拟蛋鸡产蛋期由于肝脏高强度脂代谢带来的氧化应激现象，本研究利用油酸钠诱导鸡胚原代肝细胞脂质沉积以期构建氧化应激模型，并在此模型上探究芹黄素对鸡肝细胞氧化应激的缓解效果。

2.实验材料

油酸钠高脂细胞添加剂（KC005）购自西安鲲创科技有限公司，其中：油酸钠具有常温无析出、浓度准确，无需反复加热助溶等优点。利用商品化的细胞用高脂细胞添加剂，母液含有高浓度的游离脂肪酸，由于试剂本身为液态、无菌，能与完全培养基直接互溶用于实验，减少了旧方案使用乙醇、NaOH等助溶剂（助溶剂本身有细胞毒性，混杂了高脂试剂的作用）和溶解时的加热操作，节省了操作，增强了实验的稳定性。

3. 细胞处理

鸡胚原代肝细胞培养于DMEM培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素）中，并置于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养。待细胞生长密度达到80%左右时，更换为处理培养基。试验分为对照组（DMEM培养基）、油酸钠组（DMEM培养基+400 μmol/L油酸钠）和芹黄素缓解组（DMEM培养基+400 μmol/L油酸钠+1μmol/L芹黄素），每组5个重复，处理12h后，收集细胞沉淀并检测抗氧化相关指标。

4. 油红O染色

将接种在6孔板中的细胞除去培养基后，用1X PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛固定过夜，1X PBS清洗3次后加入适量油红O工作液对细胞进行染色，染色2h后用1X PBS清洗干净，并使用倒置荧光显微镜对脂滴进行观察拍照。

之后进行细胞抗氧化指标测定、细胞总RNA提取与RT-qPCR等步骤，详细步骤见原文。

5. 结果与分析 

1） 油酸诱导对鸡胚原代肝细胞脂质沉积和抗氧化指标的影响 

油酸诱导对鸡胚原代肝细胞脂质沉积和抗氧化指标的影响见图 1和图 2。结果显示，与对照组相比，鸡原代肝细胞经油酸诱导12 h后，红色脂滴明显增多，脂质沉积显著增加（见图 1）。由图 2可知，与对照组相比，油酸组谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽 S 转移酶、超氧化物歧化酶活性均显著降低（P<0.05）。 

2）油酸诱导对鸡胚原代肝细胞抗氧化相关基因表达量的影响

油酸诱导对鸡胚原代肝细胞抗氧化相关基因表达量的影响见图3。结果显示，与对照组相比，抗氧化相关基因Nrf2、血红素加氧酶1（HO-1）、SOD和GST mRNA表达量均显著降低（P<0.05）。

之后分析了不同浓度芹黄素对鸡胚原代肝细胞增殖活力的影响，芹黄素对鸡胚原代肝细胞抗氧化基因表达的影响等，详细步骤见原文。

5.结论

蛋鸡进入到开产期后，肝脏中的脂质合成会被强烈激活以满足蛋黄形成的需要，但这一过程通常也伴随着抗氧化能力的下降。油酸作为一种重要的不饱和脂肪酸，在体外模型中被广泛应用于诱导细胞的脂肪变性。本试验选用油酸诱导鸡胚原代肝细胞来模拟蛋鸡开产后脂质合成加剧的生理状态。本研究中，油酸处理后的鸡胚原代肝细胞中能观察到明显的橘红色脂滴，是肝细胞暴露于高油酸环境后大量摄取脂肪酸，合成甘油三酯，进而发生脂质沉积所致。

有研究报道，HepG2细胞经0.5 mmol/L的油酸处理24h后谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性显著降低。杜金梁等研究发现，使用0.4 mmol/L油酸处理建鲤肝细胞48h会显著降低肝细胞超氧化物歧化酶的活性。与前述研究结果相似，在本研究中，油酸组细胞中谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽S转移酶和超氧化物歧化酶的活性均显著降低，表明油酸处理后对鸡胚原代肝细胞的抗氧化能力下降。

本研究发现油酸诱导后，鸡胚原代肝细胞抗氧化相关基因Nrf2、HO-1、SOD和GST mRNA表达水平显著下降。这些抗氧化基因表达水平的下降进一步表明鸡胚肝细胞氧化应激模型的成功构建，也验证使用油酸来模拟蛋鸡产蛋期肝脏脂质合成加剧而引发的氧化应激现象的可行性。此外，与油酸组相比，芹黄素组细胞总抗氧化能力显著升高，表明芹黄素在油酸诱导的氧化应激中发挥抗氧化作用，但具体的作用机制仍有待研究。

小编有话说：

本研究使用400 μmol/L油酸钠、12 h，处理鸡胚原代肝细胞，发现能够成功诱导氧化应激模型。大部分肝细胞，比如HepG2细胞，我们一般推荐0.5 mmol/L油酸钠+0.25 mmol/L棕榈酸钠处理48-72 h，可以达到很好的效果。不同细胞具有一定差异，具体实验中可以根据自己的细胞类型以及所要建立的模型不同而恰当选择给药浓度和处理时间。

参考文献

王雨朦，王超慧，孙喜.芹黄素缓解油酸诱导的鸡胚原代肝细胞氧化应激的作用效果 [J].中国家禽, 2024(7).