棕榈酸（钠）模拟高脂环境诱导小鼠成肌细胞C2C12 构建细胞脂质沉积模型

棕榈酸（钠）模拟高脂环境诱导小鼠成肌细胞C2C12构建细胞脂质沉积模型

重庆医科大学/博士论文

1. 前言

脂质代谢紊乱主要指血液及其他器官（脂肪组织、肝脏、骨骼肌等）中甘油三酯的异常积累，导致肥胖、代谢综合征等疾病的发生发展。骨骼肌是重要的代谢器官，在维持脂质代谢稳态中发挥着不可替代的作用。线粒体是机体中产生能量的主要场所，当骨骼肌中脂肪酸积累过多时，产生脂毒性，引起线粒体功能障碍，导致氧化磷酸化受损，ATP能量合成异常，共同诱导氧化应激状态，促进了骨骼肌的脂质代谢紊乱。

“药食同源”是中医药科学的重要组成部分，生姜是药食两用的代表药物，具有健脾开胃，温中祛湿的功效，临床上可用来治疗糖尿病等代谢性疾病。6-姜辣素是生姜的主要成分，也是发挥药理活性的主要化合物。临床研究证实，6-姜辣素在调节葡萄糖代谢，提高胰岛素敏感性，改善线粒体功能，提高脂肪酸氧化速率等方面具有有益的作用，能够明显改善机体的糖脂代谢紊乱，降低体重，缓解糖尿病等疾病的进展，但是6-姜辣素关键的作用靶点以及潜在的作用机制尚未阐明。

为了研究生姜的主要成分6-姜辣素对骨骼肌脂质代谢紊乱的影响以及其可能的分子机制，选择C2C12成肌细胞系进行体外实验，利用棕榈酸（钠）模拟高脂环境诱导骨骼肌细胞（C2C12）构建细胞脂质沉积模型，以探讨6-姜辣素的体外降脂能力以及对线粒体功能的影响。

2.实验材料

1）高脂细胞添加剂

本文采用棕榈酸（钠）高脂细胞添加剂（KC003，Xi'an Kunchuang Technology, China）作为游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs），完成体外细胞实验。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、无菌、常温无析出、低温无析出、浓度精准，无需多次加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。

2）细胞

小鼠成肌细胞（C2C12）经过成肌管分化能力验证。培养体系为：高糖DMEM+10%的胎牛血清+1%的谷氨酰胺+1%的丙酮酸钠+1%的青霉素-链霉素溶液。细胞生长在T25培养瓶中，放在37℃，5%CO₂培养箱中进行日常培养。

3. 实验方法

1）肌管诱导

将C2C12细胞均匀种于孔板中，待其密度生长至70%时，用PBS轻轻润洗细胞，更换诱导分化液（2%马血清+高糖DMEM+1%双抗），每天更换诱导分化液，共诱导5天，镜下可观察到多核的管状结构，表明肌管诱导成功。

2）模型构建及给药

6-姜辣素的溶液配制：将10mg的6-姜辣素用850μL的DMSO溶解，配制成40mM的母液，用棕色的EP管分装，避光保存在-80℃的冰箱中。

在肌管中添加250μM的PA溶液用来体外诱导骨骼肌的脂质沉积模型，对照组添加等体积的溶剂对照，6-姜辣素组中添加PA溶液的同时，加入10μM的6-姜辣素。肌管作用24h后，收集细胞进行后续实验。

3）CCK-8检测细胞活性

（1）将C2C12细胞以5000细胞/孔均匀接种于96孔板中，诱导为肌管后，饥饿8h，弃掉上清，加入不同浓度的6-姜辣素（0，1，5，10，20，40，80μM），设置空白对照组，每组设置6个副孔，在周围孔中加入等体积的PBS，防止培养液挥发。

（2）用完全培养基配制10%的CCK-8工作液，在培养箱中作用24h后，弃掉上清，更换为CCK-8工作液，在培养箱中继续培养1-2h。

（3）提前打开酶标仪，设置温度为37℃，在450nm处检测各孔的OD值，减去空白对照组的OD值后，与对照组OD值进行比较并作图。

4）细胞TG含量检测

C2C12细胞接种于6孔板中，进行诱导，加入PA和6-姜辣素作用24h后，每孔加入150μL的RIPA裂解液，用细胞刮将细胞收集到1.5mL的EP管中，超声后，4℃，12000rpm离心取上清待用，测量细胞的蛋白浓度和TG含量。

5）细胞油红O染色

弃掉6孔板中的细胞培养液，用PBS轻轻润洗3次，用4%的多聚甲醛固定细胞30min，用PBS清洗3次后，用60%的异丙醇进行预分化，弃掉上清后直接加入1mL的油红O工作液，37℃水浴避光染色30min，随后弃掉油红O染料后，用60%的异丙醇清洗2次，每次10s，除去多余的染料，用PBS清洗3次后，在白光显微镜下进行观察和拍摄。

随后，还使用流式细胞术检测细胞ROS和TMRE荧光强度，Seahorse XF检测细胞线粒体功能等。

4.实验结果分析

1）6-姜辣素降低PA诱导的C2C12肌管的脂质沉积

在体外实验中，选取小鼠成肌细胞C2C12进行6-姜辣素降脂的作用及机制研究。首先，用CCK-8实验检测了不同浓度的6-姜辣素对C2C12肌管活性的影响，可以看到80μM及以下浓度的6-姜辣素作用24h，对肌管的活性没有影响（图1A）。接下来，在细胞中加入250μM的PA来诱导肌管的脂质沉积以及线粒体功能障碍。检测了C2C12肌管中的TG的含量，可以看到10μM的6-姜辣素降低肌管中TG含量的效果最为显著，而浓度增大后，降脂的效果反而不好（图1B），同样在油红O染色实验中，10μM的6-姜辣素可以明显减少油红O的染色面积（图1C），因此，选择10μM的6-姜辣素进行后续的实验。以上结果表明，6-姜辣素可以明显降低C2C12肌管的脂质沉积。

图1  6-姜辣素降低PA诱导的C2C12肌管的脂质沉积

2）6-姜辣素降低PA诱导的C2C12肌管的ROS水平

在验证了6-姜辣素的降脂作用后，继续探讨6-姜辣素对肌管线粒体功能的影响。活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）指的是一系列来源于氧的自由基和非自由基等，具有很高的化学活性，但是当ROS浓度过高时，会发生氧化应激反应，导致细胞和组织的损伤，在细胞内，线粒体是产生ROS的主要部位，因此，检测细胞内的ROS水平，可以用来评估线粒体的功能状态。

首先用荧光显微镜观察肌管内ROS的荧光强度，对照组中几乎没有荧光，PA组中ROS的荧光强度明显增加，在6-姜辣素治疗后，肌管中的荧光强度明显减弱（图2A）。随后，用流式细胞术对ROS的荧光强度进行定量分析，结果和荧光显微镜的结果一致（图2B,C）。这提示6-姜辣素可以降低肌管内的ROS水平，从而保护线粒体。

图2  6-姜辣素降低PA诱导的C2C12肌管的ROS水平

小编有话说：

本文将C2C12成肌细胞诱导为肌管后，使用250μM的PA作用肌管24h后构建脂质沉积的模型，棕榈酸（钠）成功诱导了肌管中的脂质沉积，增加了肌管中的ROS的水平。基于该模型给药，发现6-姜辣素可能通过降低细胞内的ROS水平，增加线粒体的膜电位，以及线粒体的呼吸能力来改善线粒体功能，进而发挥减少脂质沉积的作用。此外，通过Western blotting检测了肌管中AdipoR1/AMPK信号通路相关蛋白的表达，结果提示6-姜辣素可能通过AdipoR1/AMPK信号通路改善了线粒体的功能，进而改善了脂质代谢紊乱（篇幅所限，后续结果未列出）。

上述实验条件和结果，可能会因加药时的细胞密度、代数、状态或耐药性的不同而有所区别。因此，建议具体实验中，先通过浓度、时间梯度实验，寻找出适合于所用细胞的最佳药物作用浓度和最佳作用时间，一般建议在200-500 umol/L范围内、作用24-48小时。

参考文献

彭泽.姜主要成分6-姜辣素改善骨骼肌脂质代谢紊乱的作用及机制研究[D],博士论文,2024(5).