CMBL. ; IF:9.2 |棕榈酸（PA）联合脂多糖（LPS）刺激小鼠肺泡巨噬细胞系（MH-S）诱导肥胖小鼠急性肺损伤（ALI）的经验分享

CMBL. ; IF:9.2 |棕榈酸（PA）联合脂多糖（LPS）刺激小鼠肺泡巨噬细胞系（MH-S）诱导肥胖小鼠急性肺损伤（ALI）的经验分享

Cellular & Molecular Biology Letters [2024]（  Q1; IF=9.2）

1.前言

巨噬细胞活化可能在肥胖个体对急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的易感性增加中起着关键作用。miRNA 失调与多种炎症性疾病相关，常见于肥胖患者。本研究旨在探讨miR-192在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肥胖小鼠ALI中的作用及机制。

2.体外细胞模型构建方法

小鼠肺泡巨噬细胞系（MH-S）在含有10% 胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基（Gibco）中保存，并于37°C、5% CO₂的培养箱中培养。为了模拟体内高脂环境，用100 μM棕榈酸（PA）和溶剂对照（Kunchuang，Xian，China）处理细胞。PA处理24小时后，用100 ng/ml LPS（Sigma，USA）再刺激MH-S细胞24小时。

本文中棕榈酸游离脂肪酸均源自西安鲲创科技发展有限公司（Xi'an Kunchuang Technology Development Co., Ltd）（现货号KC004、旧货号SYSJ-KJ004）。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、无菌、常温无析出、低温无析出、浓度精准，而且无需多次加热助溶，显著减少了操作步骤，提升了实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。

3.实验结果

1）肥胖时肺组织和肺泡巨噬细胞中miR-192的表达减少，并在LPS刺激下进一步减少

为了深入研究肥胖和代谢应激对肺泡巨噬细胞miR-192表达的影响，我们评估了miR-192在新鲜分离的小鼠原代肺泡巨噬细胞（AM）和棕榈酸（PA）处理的MH-S细胞中的表达。与正常小鼠相比，饮食引起的肥胖（diet-induced obese，DIO）小鼠AM中miR-192的表达显著降低，并在LPS刺激后进一步降低（图1E）。PA是最丰富的饱和脂肪酸，通常在体外用于模拟肥胖的代谢应激状态。PA处理后，MH-S细胞中miR-192的表达降低，并在LPS刺激后进一步降低（图1F）。

图1 （E）小鼠肺组织和AM中miR-192水平的RT-qPCR评估。（F）MH-S细胞中miR-192水平的 RT-qPCR评估。数据以平均值±标准差表示，*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001；****P < 0.0001。

2）肥胖小鼠m6A去甲基化增加介导miR-192表达下调

为了研究肥胖小鼠miR-192下调的原因，我们检测了肺组织中pre-miR-192（前体miR-192）和pri-miR-192（miR-192转录物）的表达。RT-qPCR结果表明，虽然pre-miR-192在肥胖小鼠的肺组织中减少，但pri-miR-192实际上增加。在新鲜提取的AM和用PA处理的MH-S细胞中观察到类似的趋势（图2B，C），表明miR-192的下调可能与pri-miR-192加工受阻有关。

图2 （B）小鼠肺组织和AM中pre-miR-192和pri-miR-192表达的RT-qPCR评估。（C）PA处理的MH-S细胞中pre-miR-192和pri-miR-192表达的RT-qPCR评估。

3）miR-192过表达可以抑制PA和LPS诱导的MH-S细胞活化和炎症

为了研究miR-192上调对巨噬细胞活化的潜在治疗作用，用miR-192激活剂（Agomir）或其对照（AgNC）处理MH-S细胞。RT-qPCR证实Agomir显著提高MH-S细胞中的miR-192表达（图3A）。ELISA分析显示，PA和LPS的组合处理促进了MH-S细胞中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的分泌，这一作用被Agomir处理减轻（图3B-D）。流式细胞术结果表明，PA和LPS联合处理有利于M1巨噬细胞表型的增加（CD86⁺CD206^-），同时减少M2表型（CD86^-CD206⁺）；这些变化在引入miR-192 Agomir后显著逆转（图3E）。在AKT/NF-κB通路上，蛋白质印迹结果显示，PA与LPS联合刺激提高了AKT和NF-κB p65的磷酸化水平，而miR-192过表达显著减弱了这些升高（图3F）。免疫荧光结果突出显示，Agomir显著减轻了由PA和LPS组合诱导的磷酸化p65的核转位，与WB结果一致（图3G）。总的来说，我们的观察结果表明，miR-192过表达抵消了由PA和LPS触发的巨噬细胞活化和炎症。

图3 miR-192过表达可抵消PA和LPS诱导的MH-S细胞活化和炎症。用miR-192激活剂（Agomir）或其对照（AgNC）处理MH-S细胞。在MH-S细胞中，（A）Agomir处理后miR-192表达的RT-qPCR结果。（B-D）细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平的B-DELISA测定。（E）流式细胞术分析MH-S细胞中M1巨噬细胞（CD86⁺CD206⁻）和M2巨噬细胞（CD86⁻CD206⁺）的比例。（F）WB评估p-AKT、AKT、p-p65和p65水平。（G）细胞核p-p65转位的免疫荧光。红色代表p-p65，蓝色代表DAPI染色的细胞核。比例尺，20μm。数据以平均值±标准差表示。**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns，无显著性差异。

4.结论

在用棕榈酸（PA）处理MH-S细胞（用于模拟肥胖的代谢应激）后，miR-192表达显著降低。miR-192的过表达显著抑制PA和LPS诱导的巨噬细胞活化和炎症。此外，在用PA处理后，MH-S细胞中FTO的蛋白水平降低，并且在LPS刺激后进一步减少。研究表明，巨噬细胞是肥胖加重LPS诱导的ALI的关键介质，并揭示肥胖诱导的miR-192下调通过促进巨噬细胞活化来减轻LPS诱导的ALI。这些结果表明，靶向巨噬细胞和miR-192可能为肥胖相关的ALI提供新的治疗途径。

小编有话说：

棕榈酸是最丰富的饱和脂肪酸，通常在体外用于模拟肥胖的代谢应激状态。本文采用100μM棕榈酸（PA）刺激小鼠肺泡巨噬细胞系（MH-S）24h，然后再使用100 ng/ml LPS刺激MH-S细胞24小时，成功建立体外肥胖患者急性肺损伤模型。

上述实验条件和结果，可能会因加药时的细胞密度、代数、状态或耐药性的不同而有所区别。因此，建议具体实验中，先通过浓度、时间梯度实验，寻找出适合于所用细胞的最佳药物作用浓度和最佳作用时间，一般建议在100-500 umol/L范围内、作用24-48小时。

此外，还建议待细胞生长至80-100% 汇合度时，弃掉原培养基，换成现配（不要多配，现配现用）的高脂试剂混合液（一般使用含10% FBS，1% P/S的完全培养基，与高脂试剂配成所需浓度的混合液，混匀），然后将细胞放入细胞孵箱中继续培养，避免把高脂试剂滴加到培养皿中，因为在摇匀前，局部高浓度的高脂试剂可以瞬间杀死细胞。所以，建议先配制好高脂试剂混合液，待混匀后，轻柔地加入细胞培养皿中，这样所有细胞接触到的都是等浓度的高脂试剂。

参考文献

SiqiWu, Wenjing Tang, et al. " Obesity-induced downregulation of miR-192 exacerbates lipopolysaccharide-induced acute lung injury by promoting macrophage." Cellular & Molecular Biology Letters, 2024.