高糖高脂刺激原代下丘脑神经元诱导胰岛素抵抗模型（IF=6.7）

高糖高脂刺激原代下丘脑神经元诱导胰岛素抵抗模型（IF=6.7）

Phytomedicine [2024] （IF=6.7）

1. 前言

2型糖尿病（type2diabetesmellitus，T2DM）是一种以胰岛素抵抗或胰岛素分泌减少为主要特征的严重内分泌疾病。由于T2DM在全球范围内的患病率不断增加，自1980年以来，在成人人群中的患病率从4.7%上升至约10.5%，因此，迫切需要探索通过抑制食物摄入和/或增加能量消耗来有效治疗糖尿病的机制和药物。

弓状核(ARC)是下丘脑的重要组成部分，在能量代谢调节中起着重要作用，下丘脑能量代谢调节紊乱常常是糖尿病的病理生理学基础。由于弓状核(ARC)位置靠近第三脑室和相对可渗透的血脑屏障，ARC可以快速而灵敏地接收来自外周的能量信号，如胰岛素。胰岛素穿过血脑屏障，与下丘脑AgRP和POMC神经元上的特异性受体结合。这导致胰岛素受体(INSR)底物磷酸化和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶A(AKT)/叉头盒O1(FOXO1)通路的激活，从而调节POMC/AgRP神经元的兴奋性。

金匮肾气丸（JSP）是一种调节下丘脑功能、治疗糖尿病的中成药，为了在体外细胞实验中验证JSP是否可以通过调节POMC/AgRP的表达和活性而改善糖尿病的症状，利用葡萄糖和棕榈酸溶液刺激原代下丘脑神经元诱导胰岛素抵抗。

2. 高糖高脂细胞添加剂

文中高糖高脂细胞添加剂（棕榈酸、棕榈酸钠、葡萄糖、甘露醇等溶液）源自西安鲲创科技发展有限公司（Xi'an Kunchuang Technology Development Co., Ltd）（货号KT002）。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、无菌、常温无析出、低温无析出、浓度精准，而且无需多次加热助溶，显著减少了操作步骤，提升了实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。

3. 胰岛素抵抗模型构建方法

为了确定胰岛素诱导的PI3K/AKT/FOXO1信号通路是否在JSP介导的POMC/AgRP平衡中起作用，设置了六组实验：

1）对照组（10%对照血清）

2）M组（10%对照血清+Glu/PA）

3）5% JSP组（Glu/PA+5%JSP血清）

4）10%JSP组（Glu/PA+10%JSP血清）

5）15%JSP组（Glu/PA+15%JSP血清）

6）J+LY（Glu/PA+10%JSP血清+50μMLY294002）组。

将细胞培养至80%汇合，然后用Glu（30mM）和PA（0.3mM）处理。在Glu/PA干预后24h，将JSP血清加入到细胞培养基中。此外，建议按适当浓度滴加高脂细胞添加剂，对照组加入等量溶剂对照，轻柔混匀后将细胞放入细胞孵箱中继续培养。

后期，使用检测试剂盒按照制造商的说明测量细胞死亡，细胞用PBS洗涤两次，然后在室温下用5μl膜联蛋白V-FITC和5μ1碘化丙啶处理。15分钟后，使用流式细胞术对细胞进行细胞死亡分析。

4.实验结果

图1A和B显示，向神经元中添加30mM葡萄糖和0.3mM PA在12和24h抑制细胞增殖活性（p<0.01）。在2.5%至15%的梯度浓度下，含JSP的血清干预逆转了这种变化。不同剂量的含药血清作用12h后，细胞增殖活性略有提高，10%含药血清作用24h后达到高峰。我们进一步采用流式细胞术定量分析细胞死亡的标志物膜联蛋白V和PI。与CON组相比，M组中膜联蛋白V+/PI+的百分比增加，支持体外模拟胰岛素抵抗的高葡萄糖和PA促进下丘脑神经元中的细胞死亡（图6C和D）。与M组相比，在10%JSP组中观察到细胞死亡减少（p<0.05），JSP的这种保护作用可被PI3K抑制剂（LY294004）逆转，如J+LY组所证明的（p<0.05）。这些结果表明，JSP的神经保护作用与PI3K信号通路密切相关。

图1  JSP可减轻胰岛素抵抗引起的下丘脑神经元死亡。在用高糖和棕榈酸诱导后（A）12 h和（B）24 h检测浓度范围为2.5%至15%的含JSP血清对下丘脑神经元增殖活性的影响（n = 6）。(C)通过流式细胞术检测组间的细胞死亡。(D)在不同组中进行的细胞死亡率的比较分析（n = 3）。数据以平均值± SD表示。* P < 0.05。** 与CON组相比p < 0.01;与M组相比# p < 0.05，## p < 0.01;与JM组相比& p < 0.05，&& p < 0.01。

5.结论

在本研究中，JSP通过调节POMC/AgRP神经元的表达和活性，改善下丘脑的胰岛素抵抗，从而改善糖尿病，上述结果为JSP在糖尿病管理中的应用提供了经验证据。

小编有话说：

本文采用300μM棕榈酸（PA）联合30mM葡萄糖（Glu）刺激原代下丘脑神经元成功诱导胰岛素抵抗。上述实验条件和结果，可能会因加药时的细胞密度、代数、状态或耐药性的不同而有所区别。因此，建议具体实验中，先通过浓度、时间梯度实验，寻找出适合于所用细胞的最佳药物作用浓度和最佳作用时间，一般建议在200-500 umol/L范围内、作用24-48小时。

参考文献

Shan Zhang, Yueying Zhang, et al. Jinkui Shenqi pills ameliorate diabetes by regulating hypothalamic insulin resistance and POMC/AgRP expression and activity. Phytomedicine, 2024.