棕榈酸PA（棕榈酸钠SP）诱导BEECs细胞凋亡、脂质堆积、线粒体功能障碍并增强自噬（IF=6.3）

棕榈酸PA（棕榈酸钠SP）诱导BEECs细胞凋亡、脂质堆积、线粒体功能障碍并增强自噬（IF=6.3）

Journal of Animal Science and Biotechnology [2024]（IF=6.3）

1. 前言

负能量平衡（NEB）通常发生在奶牛分娩后。高产奶牛更有可能发生显著的NEB。这种代谢失衡可能导致酮症，并常伴随繁殖性能的下降。然而，NEB的分子机制尚未完全阐明。在过度NEB期间，体内脂肪被大量分解，导致以棕榈酸（PA）为代表的非酯化脂肪酸（NEFAs）在子宫内异常蓄积。这种异常蓄积可能损伤牛子宫内膜上皮细胞（BEECs），而其参与PA诱导BEECs损伤的分子机制仍知之甚少。褪黑素（Melatonin，MT）在维持线粒体活性氧（mitoROS）的稳态中起重要作用。然而，MT是否能改善PA诱导的BEECs损伤及其分子机制尚知之甚少。

2.体外细胞模型构建方法

采用0.2 mmol/L至0.4 mmol/L的PA作用12至24小时可以增加细胞和线粒体的氧化应激水平，如活性氧（ROS）水平增加所示。本文中棕榈酸（PA）源自西安鲲创科技发展有限公司（Kunchuang biotechnology，Xi'an，China）（现货号KC002、旧货号SYSJ-KJ002）。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、无菌、常温无析出、低温无析出、浓度精准，而且无需多次加热助溶，显著减少了操作步骤，提升了实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。

3.实验结果

1）PA诱导BEECs细胞凋亡

在复苏和培养后，观察到细胞状况良好。免疫荧光（IF）结果显示，超过99%的细胞表达上皮细胞标志物角蛋白CK18（图1A），表明细胞纯度很高可用于后续实验。我们采用0.2 mmol/L至0.4 mmol/L的PA以建立PA高脂应激模型，PA处理后BEECs脂质含量显著增加，并呈剂量依赖性(Fig.1B，P<0.05）。这些结果证明该模型建立成功。接下来，我们发现细胞活力（图1C，P<0.05）和增殖率（图1D和E，P<0.05）均以剂量依赖性方式显著降低。流式细胞术数据还显示，给予0.2 mmol/L PA处理后存活细胞数显著减少（P<0.05）；与对照组相比，早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例显著增加（图1F和G，P<0.05）。根据细胞活力、增殖和凋亡数据，我们选择0.2 mmol/L PA处理进行后续实验。然后，我们检测了0.2 mmol/L PA处理后，凋亡相关的mRNA和蛋白的表达。结果显示，PA处理后，促凋亡基因（Caspase3，BAX/BCL2）的mRNA表达显著升高（P<0.05），凋亡相关蛋白（cleaved-Caspase3，BAX）也显著上调（图1H-J，P<0.01）。而BAX/BCL2蛋白的表达水平无差异。总的来说，这些数据表明PA处理诱导了BEECs凋亡。

2）PA增强BEECs的过氧化作用

PA产生的脂毒性诱导的细胞凋亡通常与氧化应激有关。我们发现细胞内和线粒体ROS水平均显著上调（图2A-B和2 E-F，P < 0.05）。此外，在PA刺激下，氧化产物MDA的水平显著增加（图2C，P < 0.01），并且抗氧化剂的活性在PA刺激下显著降低（图2C，P < 0.01）。抗氧化剂活性SOD酶活性显著降低（图2D，P < 0.05）。我们的数据表明，PA诱导的BEECs细胞凋亡增加可能与氧化损伤有关，特别是在线粒体中。

图1 PA诱导BEECs凋亡。（A）BEECs中CK18染色的代表性图像（比例尺=50μm）。（B）油红O染色（×400）的代表性图像和分析（n=3）。（C）在不同浓度的PA刺激下BEEC的细胞活力（n=5）。（D）EDU染色的代表性图像。（E）EDU染色的分析（n=3）。（F,G）用PA刺激BEECs后，通过流式细胞术分析对照组和PA处理组中BEECs的凋亡（n=3）。（H）对照组和PA组（n=3）中BAX、BCL2、Caspase3的qRT-PCR分析。（I,J）对照组和PA组（n=3）中BAX、BCL2、切割的半胱天冬酶3的蛋白质印迹分析。对于B-D、H和I，我们使用单因素方差分析进行显著性差异分析（不同小写字母表示P<0.05）;对于H和I，我们使用学生t检验来鉴定显著性差异（*P<0.05；*P<0.01）；数据以平均值±SEM显示。

图2 PA诱导BEEC线粒体氧化应激。（A,B）对照组和PA-0.2mmol/L组的cROS水平（n=3）。（C）对照组和PA-0.2 mmol/L组的MDA水平（n=3）。（D）对照组和PA-0.2 mmol/L组的SOD活性（n=5）。（E,F）对照组和PA-0.2 mmol/L组的MitoROS水平（n=3）。对于B-D和F，我们使用Studentt检验确定显著差异（*P<0.05;**P<0.01）；数据显示为平均值±SEM。

3）PA诱导BEEC线粒体功能障碍

PA是一种能量代谢底物，线粒体作为细胞内进行脂肪酸氧化的细胞器，在PA应激后，随着线粒体ROS水平升高，BEECs的结构和功能可能受到损害。透射电镜（TEM）显示PA组中的线粒体发生肿胀、嵴溶解和膜破裂（图3A）。统计学分析显示，与对照组相比，受损线粒体的比例显著增加（图3C，P<0.05）。线粒体结构的损伤通常导致线粒体功能障碍，例如MMP的下降，如JC-1染色（图3G）和细胞流式细胞术（图3H和I）所示。提取的线粒体与OXPHOS抗体孵育后，NDUFB8（复合物I，P<0.05）和SDHB（复合物II，P<0.01）蛋白的表达水平显着降低，同时MTCO1（复合物IV）呈下降趋势（图3J-M）），表明PA损害了电子呼吸链的功能。使用Seahorse分析仪进行的OCR分析表明，PA刺激后，线粒体基础细胞呼吸、ATP产生和最大耗氧量均显著下降（图3N-Q，P<0.01），这是线粒体呼吸功能受损的结果。这些观察结果表明，PA诱导的线粒体功能障碍有助于驱动BEECs的损伤。有趣的是，我们发现短杆状线粒体的数量增加，这可能是线粒体分离出来的受损部分。此外，我们通过TEM检测到线粒体数量的减少（图3B，P<0.05），以及线粒体DNA水平的降低（图3D-F），这可能是活跃的自噬引起的。

4）PA激活BEEC中的自噬

为了研究PA是否能激活自噬，我们首先检测了线粒体自噬相关基因（PINK、PARKIN、LC3B、PARL和P62）的mRNA表达，发现它们在0.2 mmol/L PA处理后均显著增加。同时，BEECs中PINK、PARKIN、LC3-II/I和P62的蛋白表达水平也增加，表明更多的线粒体被标记为自噬。我们进一步提取线粒体，以探索PINK、PARKIN、P62和泛素（Ub）的表达，这些蛋白在自噬前期位于或连接到线粒体。P62和Ub蛋白的水平显著增加，而PINK和PARKIN的蛋白水平也略上调（但不显著，P > 0.05），进一步支持我们之前的结果。然后，转染mCherry-GFP-LC3B显示，PA处理后BEECs中的红点显著增加，这初步提示已经形成了更多的自噬小体。上述结果证明自噬前准备工作已充分完成。此外，通过TEM测定，PA处理后BEECs中的溶酶体数量显著增加。LysoTracker染色也表明溶酶体的数量显著增加。PA组除溶酶体数量增加外，PA组具有较强的荧光强度，表明PA显著降低了pH值。LAMP 1和Cat B蛋白表达的增加与我们早期的发现一致。这可能意味着细胞增加了溶酶体的数量和功能，以满足自噬体大量增加的需求。从自噬前后的阶段来看，PA处理后线粒体自噬确实增强。然而，同样值得注意的是，P62蛋白的表达水平显著升高，这可能是自噬增强但未能阻止凋亡的主要原因。

图3 PA导致BEECs中线粒体功能障碍。（A）3组中TEM的代表性图像（比例尺=5和2μm）。正常线粒体用红星标记，异常线粒体用红色圆圈标记，溶酶体用红色三角形标记。（B）TEM图中线粒体平均数的统计分析（n=3）。（C）异常线粒体的TEM统计分析（n=3）。（D-F）线粒体拷贝数分析。采用特异性COX1、ND1和ATP6基因测定法进行测定（n=3）。（G）对照组和PA-0.2 mmol/L组中JC-1染色的代表性图像（n=5）。（H,I）通过流式细胞术测定的JC-1细胞的代表性图像和分析图（n=3）。（J-M）对照组和PA组中OXPHOS的蛋白质印迹分析（n=3）。（N）对照组和PA-0.2 mmol/L组的OCR。（O-Q）通过Seahorse分析仪测定的基础呼吸、ATP生成以及最大呼吸（n=4）。使用学生t检验来鉴定显著差异（*P<0.05;**P<0.01）；数据显示为平均值±SEM。

4.总结

本文观察到线粒体功能障碍，包括线粒体结构和呼吸功能的异常，同时线粒体膜电位和线粒体拷贝数减少，并诱导了细胞凋亡。值得注意的是，研究者还观察到自噬相关蛋白（PINK，Parkin，LC3B和Ubiquitin）的上调，然而，P62蛋白也有所增加。100μmol/L MT预处理可抑制PA诱导的线粒体ROS，恢复线粒体呼吸功能。同时，MT预处理可逆转PA诱导的P62蛋白表达上调，激活AMPK-mTOR-Beclin-1通路，促进自噬增加，凋亡减少。

总而言之，过量PA刺激，导致了BEECs线粒体氧化应激和功能障碍，并增强自噬，从而引发了细胞凋亡。MT预处理降低了线粒体氧化应激，并通过AMPK-mTOR-Beclin-1途径进一步增强了受损线粒体的自噬清除，这共同减轻了PA诱导的线粒体功能障碍和BEECs的凋亡。本研究阐明了PA如何对BEECs产生损伤的机制，以及MT如何减轻PA诱导的BEECs损伤，这为预防NEB引起的生殖障碍提供了机制参考。

小编有话说：

本文先以梯度浓度的PA（0.2 mmol/L、0.4 mmol/L）作用牛子宫内膜上皮细胞（BEECs）12、24小时，建立细胞损伤模型。然后，根据细胞活力、增殖和凋亡数据，作者选择0.2 mmol/L PA处理BEECs进行后续实验。上述实验条件和结果，可能会因加药时的细胞密度、代数、状态或耐药性的不同而有所区别。因此，建议具体实验中，先通过浓度、时间梯度实验，寻找出适合于所用细胞的最佳药物作用浓度和最佳作用时间，一般建议在100-500 umol/L范围内、作用24-48小时。

参考文献

Yi Wang, Jianfei Gong, Nuo Heng, et al. " Melatonin alleviates palmitic acid‑induced mitochondrial dysfunction by reducing oxidative stress and enhancing autophagy in bovine endometrial epithelial cells." Journal of Animal Science and Biotechnology.