棕榈酸刺激模拟高糖高脂诱导心肌细胞（AC16）损伤模型

棕榈酸刺激模拟高糖高脂诱导心肌细胞（AC16）损伤模型

李冰/吉林大学/博士论文

1. 前言

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一种对全球公共卫生构成巨大威胁的疾病，预计到2040年至少有6.4亿人将患上2型糖尿病（Type2 diabetes mellitus，T2DM）。T2DM是一种慢性疾病，其特点是随着时间的推移，由糖尿病引起的高血糖和高脂血症会引发多个器官的不可逆性损害。糖尿病患者更容易患上心血管疾病，其中糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyoSPthy，DCM）预后较差。DCM通常以弥漫性心肌纤维化、心脏肥大、大量活性氧自由基（ROS）产生和过度炎症反应为特征，最终导致心脏功能障碍。

为了验证药物对心肌损伤的改善作用，研究其对DCM的潜在保护效果及其作用机制，需要构建体外心肌细胞损伤模型。目前，通过高葡萄糖（HG）联合棕榈酸（SP）或棕榈酸钠（SP）刺激模拟高糖高脂诱导心肌细胞损伤的方法已广泛用于DCM的体外研究。

2.实验材料

本文以心肌细胞（AC16细胞系）为对象，采用棕榈酸钠高脂细胞添加剂（KC002，Xi'an Kunchuang Technology, China）作为游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs），完成体外细胞实验。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、无菌、常温无析出、低温无析出、浓度精准，而且无需多次加热助溶，显著减少了操作步骤，提升了实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。

3. 实验方法

AC16 细胞系是一种人类心肌细胞系，广泛应用于心血管疾病的研究。心肌细胞在37℃、5% CO₂ 的湿润培养箱中，使用含有1：100 青/ 链霉素（1% P/S）和10% 胎牛血清（10% FBS）的低糖DMEM 培养基（含5.5 mM D-葡萄糖）进行培养。AC16细胞的处理方式如下：

（1）阴性对照（NC）组：5.5mM D-葡萄糖+棕榈酸钠的溶剂对照；

（2）SP+HG组：300μM棕榈酸钠+33mM D-葡萄糖；

（3）SP+HG+Clo组：300μM棕榈酸钠、33mM D-葡萄糖和10μM氯吡格雷。

AC16细胞用10μM的氯吡格雷预处理1h，然后添加300μM的棕榈酸钠+33mM的D-葡萄糖处理48h构建T2DM细胞模型，以测定细胞大小、ROS水平以及氧化应激相关信号通路的变化，分析氯吡格雷的作用效果和机理。

需要说明的是，棕榈酸钠的作用浓度是通过梯度实验得出，具体如下：

在棕榈酸钠（SP）溶液毒性测定过程中，设置对照组+实验组+空白组，每组设5个重复，按照浓度梯度0μM、100μM、200μM、300μM、400μM和500μM加入SP溶液处理，此外实验组中每孔分别加入33mM的D-葡萄糖溶液，待处理48h后更换培养基，然后每孔加入CCK-8工作液（CCK-8溶液与培养基比值为1:9），培养箱内孵育2h，用酶标仪检测450 nm处的吸光度。

图1 AC16心肌细胞的细胞活力测定

图中，利用CCK-8方法评估高葡萄糖（HG，33mM）联合不同浓度棕榈酸钠对AC16人心肌细胞存活率的影响。棕榈酸钠对AC16心肌细胞的半数最大抑制浓度范围为300–400μM。据此，最终选用300μM的SP浓度和33mM的HG浓度建立2型糖尿病细胞模型。

4.实验结果分析

如图2A所示，与NC组相比，SP+HG组的AC16心肌细胞明显增大，而氯吡格雷治疗能有效减轻由高糖高脂引起的这种心肌细胞肥大。此外，通过Western blot观察到，相比较于NC组，SP+HG组的AC16心肌细胞中MYH7和ANP的蛋白水平显著升高，而这些升高的蛋白水平在经过氯吡格雷治疗后得到了缓解（图2B）。

图2 氯吡格雷改善糖脂毒性引起的AC16心肌细胞肥大和氧化应激损伤

此外，还观察到与NC组相比，SP+HG组的AC16心肌细胞中ROS水平显著升高，而氯吡格雷治疗缓解了高糖高脂毒性引起的细胞ROS损伤（图2C）。通过进一步的Western blot分析，发现相较于NC组，SP+HG组的AC16心肌细胞中Nrf2、HO-1和NQO-1的蛋白水平显著降低，而经过氯吡格雷治疗后这些蛋白水平得到了提升（图2D）。

综上，从体外细胞实验进一步证实了氯吡格雷可以通过激活Nrf2信号通路对抗糖尿病心肌氧化应激损伤，改善心脏细胞肥大，从而促进心肌重构的改善。

小编有话说：

本文采用300μM棕榈酸钠、48h处理AC16心肌细胞系模拟肥胖患者体内高糖高脂环境，体外实验表明AC16心肌细胞在高糖高脂刺激后表现出细胞体积增大和ROS水平升高。此外，AC16心肌细胞在高糖高脂刺激后，Nrf2抗氧化途径（Nrf2、HO-1和NQO-1）的蛋白表达受到显著抑制。本研究为糖尿病心肌病的治疗提供了良好的细胞模型，具有参考价值。

参考文献

李冰. 氯吡格雷在改善2型糖尿病引起的心肌病中的作用机制和治疗潜力[D]，吉林大学，博士论文，2024(6).