高糖高脂（棕榈酸酯、棕榈酸、棕榈酸钠）诱导的心肌细胞损伤

0. 摘要

将H9C2细胞分为对照组(正常培养)、溶剂组(高脂溶剂+ 0.1% 二甲基亚砜)、高脂高糖组(0.1mmol·L^-1 的棕榈酸和50 mmol·L^-1的葡萄糖)、低剂量组(高脂高糖诱导+ 5μg·L^-1的阿昔莫司)、中剂量组(高脂高糖诱导+ 10 μg·L^-1的阿昔莫司)、高剂量组(高脂高糖诱导+ 25 μg·L^-1的阿昔莫司)。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组细胞增殖情况;用流式细胞术和TUNEL法检测各组细胞凋亡情况;用蛋白质印迹(Western blot)法检测各组细胞蛋白表达水平;并检测各组细胞氧化应激相关指标水平。

高脂高糖组上述指标分别与对照组、溶剂组比较，差异均有统计学意义(均P＜0.05);高脂高糖组上述指标与低剂量组、中剂量组、高剂量组比较，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。

1. 前言

随着生活水平和人口老龄化的加剧，糖尿病的发病率也在逐年增加，糖尿病对机体的危害主要是由糖尿病引起的各种并发症，其中糖尿病并发心血管疾病(糖尿病性心肌病)具有较高的致残率和致死率。心肌损伤是糖脂代谢异常的微血管并发症之一，在病理情况下，心肌细胞线粒体功能受到破坏，引起氧化应激，给机体组织带来不可逆损伤。阿昔莫司是一种降血脂药物，在临床上常用于治疗高胆固醇血症、高三酰甘油血症及冠心病。研究发现，阿昔莫司对高糖诱导的心肌细胞具有保护作用，但其对高糖高脂诱导的心肌细胞的保护作用还不清楚。本研究旨在通过体外构建高糖高脂心肌细胞模型，探究阿昔莫司对高糖高脂型心肌细胞损伤的作用及其机制，以期为阿昔莫司在糖尿病性心肌病领域的治疗提供思路。

2.材料

棕榈酸钠及高脂溶剂对照，均购自西安鲲创科技发展有限公司。利用商品化的细胞用高脂毒性试剂，母液含有高浓度的游离脂肪酸，由于试剂本身为液态、无菌，能与完全培养基直接互溶用于实验，减少了旧方案使用乙醇、NaOH等助溶剂（助溶剂本身有细胞毒性，混杂了高脂试剂的作用）和溶解时的加热操作，节省了操作，增强了实验的稳定性。

3.方法

3.1 细胞培养

H9C2心肌细胞培养在DMEM培养基中(含有10%胎牛血清)，置于恒温培养箱(37℃，5%CO2)中培养，待细胞融合至约80%时消化使用0.25%胰蛋白酶进行和传代。

3.2模型构建

收集对数期生长的心肌细胞，加入含有不同浓度(0、0.05、0.1、0.2和0.4mmol·L^-1)棕榈酸(palmitic acid，PA)的DMEM培养基处理细胞48h，使用CCK-8法检测细胞存活率，筛选干预浓度。葡萄糖浓度参考文献，最终使用0.1mmol·L^-1的PA和50mmol·L^-1的葡萄糖诱导细胞。

3.3细胞分组与药物处理

将H9C2细胞分为对照组、溶剂组(vehicle)、高脂高糖组(HGPA)、低剂量组(HGPA+L－ACI)、中剂量组(HGPA+M－ACI)、高剂量组(HGPA+H－ACI)，对照组为正常培养的细胞，溶剂组细胞使用高脂溶剂和0.1%的二甲基亚砜处理细胞，高脂高糖组使用0.1mmol·L^-1的PA和50mmol·L-1的葡萄糖处理细胞，低、中、高剂量组分别使用0.1mmol·L^-1的PA、50mmol·L^-1的葡萄糖及5、10和25μg·L^-1的阿昔莫司(0.1%的二甲基亚砜配制)干预细胞。

3.4以CCK－8法检测各组细胞增殖

收集细胞，消化后调整细胞密度，取细胞稀释液100μL接种于96孔板(每孔约2000个细胞)，每组设6个复孔，培养箱培养24h后，按照“2.2”和“2.3”中方法处理细胞，在干预48h后，每孔加入的CCK－8试剂10μL，并置于培养箱中培养2h后使用酶标仪在波长为450nm处检测光密度值(optical density，OD)，并计算细胞存活率。

4.结果与分析

4.1 不同浓度的PA对H9C2细胞存活率的影响

0、0.05、0.1、0.2和0.4mmol·L^-1的PA处理细胞后，细胞存活率分别为(100.00±3.21)%、(96.79±8.05)%、(72.31±6.13)%、(41.20±4.34)%和(32.41±4.75)%，0.1、0.2和0.4mmol·L^－1的PA处理细胞后，细胞存活率均显著降低(均P＜0.05)。由于0.1mmol·L－1的PA处理细胞后，细胞存活率开始显著下降，因此后续实验PA的剂量选择为0.1mmol·L^－1。

4.2阿昔莫司对高脂高糖H9C2细胞增殖的影响

对照组为正常培养的细胞，溶剂组细胞用高脂溶剂和0.1%的二甲基亚砜处理细胞，高脂高糖组用0.1mmol·L^－1的PA和50mmol·L^－1的葡萄糖处理细胞，低、中、高剂量组分别用0.1mmol·L^－1的PA、50mmol·L^－1的葡萄糖及5、10和25μg·L^－1的阿昔莫司(0.1%的二甲基亚砜配制)干预细胞。对照组、溶剂组、高脂高糖组、低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞活性(OD值)分别为1.34±0.11、1.29±0.12、0.43±0.05、0.52±0.06、0.79±0.07和0.99±0.10，高脂高糖组细胞OD值分别与对照组、溶剂组比较，均显著降低(均P＜0.05);与高脂高糖组比较，低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞OD值均显著升高(均P＜0.05)。

4.3阿昔莫司对高脂高糖H9C2细胞自噬的影响

对照组、溶剂组、高脂高糖组、低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平分别为1.10±0.11、1.09±0.12、0.32±0.04、0.45±0.06、0.64±0.07和0.91±0.08，Beclin－1蛋白表达水平分别为0.89±0.08、0.93±0.09、0.23±0.04、0.41±0.04、0.59±0.07和0.82±0.09，p62蛋白表达水平分别为0.30±0.04、0.32±0.02、0.97±0.08、0.64±0.06、0.50±0.05和0.39±0.04。高脂高糖组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平、Beclin－1蛋白水平分别与对照组、溶剂组比较，均显著减少(均P＜0.05)，p62蛋白水平均显著增加(均P＜0.05);与高脂高糖组比较，低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平、Beclin－1蛋白水平均显著增加(均P＜0.05)，p62蛋白水平均显著减少(均P＜0.05)，见图1。

                                              图1各组细胞自噬相关蛋白表达水平

5讨论

糖尿病性心肌病是糖尿病患者的主要并发症之一，也是重要的致死因素，糖尿病性心肌病的发病机制较为系统，其病理特征表现为心肌细胞凋亡、心肌纤维化、心脏肥大及心功能下降等。目前针对糖尿病心肌病的主要治疗方式包括2种:一种是药物治疗与生活方式干预联合治疗，另一种是使用如二甲双胍等降糖药物进行治疗，但疗效并不理想。在人体内，高糖与高脂关系密切，目前关于糖尿病高血脂症的并发症研究多集中于用单一的高糖或高脂因素构建损伤模型，其所提供的实验依据对于糖脂代谢相关疾病的研究显得不够确切。本研究通过构建高脂高糖H9C2细胞损伤模型探究调脂药物阿昔莫司在糖脂代谢相关心肌病中的作用。本研究结果发现，模型组的细胞各时间点的OD值较对照组和溶剂组均显著降低，而不同浓度的阿昔莫司处理后，心肌细胞不同时间点的OD值均显著增加，提示阿昔莫司可显著促进高糖高脂诱导的心肌细胞增殖。解园星等也在研究中证实了阿昔莫司可提高高糖诱导的H9C2细胞的存活率。

小编有话说：

本文是使用高脂试剂比较规范的一个实例，作者在正式实验前，在固定葡萄糖浓度（50mmol·L^－1）的情况下，分别使用0、0.05、0.1、0.2和0.4mmol·L^-1梯度浓度的棕榈酸（palmitic acid，PA）处理H9C2细胞，根据CCK-8实验结果选择了0.1 mmol·L^-1的PA作为干预浓度，在此基础上验证了阿昔莫司对H9C2的保护作用。由于不同细胞对高脂试剂（棕榈酸、棕榈酸钠、棕榈酸酯）的耐受能力不同，甚至不同代数和密度都会影响细胞对高脂试剂的耐受能力，为了获得稳定的实验结果，建议首次使用时进行梯度浓度实验，寻找最适于自己实验要求的浓度和时间。

参考文献

陈兰，刘晓霞，李彩娣，等. 阿昔莫司介导自噬途径保护高糖高脂诱导的心肌细胞损伤[J]. 中国临床药理学杂志, 2023, 11.