游离脂肪酸FFAs（棕榈酸钠、油酸钠）诱导AML-12细胞建立肝细胞脂肪变性模型

游离脂肪酸FFAs（棕榈酸钠、油酸钠）诱导AML-12细胞建立肝细胞脂肪变性模型

中药材/中文核心（2024-11）

1. 前言

随着对病毒性肝炎的阻断和控制,非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)成为全球第一大肝病,其包括从单纯脂肪变性到脂肪性肝炎的一系列肝脏疾病,后者可发展为进行性肝纤维化、肝硬化,并最终导致肝细胞癌。NAFLD的发病涉及胰岛素抵抗、氧化应激、内质网应激、炎症因子和肠道菌群失调等机制,且各机制之间相互影响、相互促进。长期脂质蓄积或高脂饮食可降低自噬水平。适当的自噬有助于调节脂质代谢,维持线粒体功能稳态及抑制促炎因子的产生。

研究表明白藜芦醇(resveratrol)可减轻肝纤维化和脂肪变性,保护肝脏免受化学性、胆汁淤积性和酒精介导的损伤,提高Wistar大鼠肝移植术后的存活率,减少缺血引起的坏死和凋亡。但其改善NAFLD的具体机制仍有待研究。本研究通过体外实验观察白藜芦醇对游离脂肪酸(FFAs)诱导的肝细胞脂肪变性的改善作用是否与促进自噬有关,并对其机制进行分析,为白藜芦醇用于NAFLD的临床治疗提供理论依据。

2. 游离脂肪酸FFAs

文中游离脂肪酸FFAs为西安鲲创科技发展有限公司（Xi'an Kunchuang Technology Development Co., Ltd）的高脂细胞添加剂（棕榈酸钠、油酸钠）（货号KC006）。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、无菌、常温无析出、低温无析出、浓度精准，而且无需多次加热助溶，显著减少了操作步骤，提升了实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。

3. 细胞模型构建方法

1）CCK-8检测细胞活力

将处理好的细胞悬液接种于96孔板,用不同浓度(20、40、60、80、100μmol/L)的白藜芦醇培养24h,然后加入10μL/孔的CCK-8溶液继续孵育2h,450nm处测光密度D(λ)值。

2）分组、造模与给药

根据CCK-8结果选择白藜芦醇的最适浓度(100μmol/L)继续后续研究。将AML-12细胞分为正常对照组、模型组、白藜芦醇(100μmol/L)组、RAPA(100nmol/L)组、3-MA(5mmol/L)组、3-MA+白藜芦醇组、Compound C(10μmol/L)组、Compound C+白藜芦醇组。除正常对照组细胞用正常培养基培养外,其余各组细胞用油酸钠∶棕榈酸钠=2∶1（500μmol/L油酸钠联合250μmol/L棕榈酸钠）处理48h建立肝细胞脂肪变性模型。联合用药组在用3-MA或Compound C预处理2h后加入白藜芦醇,各组细胞均培养24h。

之后，进行油红O染色、细胞内TG含量检测、AO/PI检测细胞凋亡、Western Blot法检测自噬相关蛋白及AMPK/mTOR信号通路的表达等操作。

4.结果与分析

1）白藜芦醇对AML-12细胞活力的影响

结果如图1所示,不同浓度的白藜芦醇作用24h后,AML-12细胞活力随着药物浓度的增加而逐渐降低。在后续研究选择100μmol/L为实验浓度。

图1 不同浓度的白藜芦醇对AML-12细胞活力的影响

2）白藜芦醇对FFAs诱导下AML-12细胞TG含量的影响

结果如图2所示,与正常对照组比较,模型组细胞TG含量显著升高(P<0.01)。与模型组比较,白藜芦醇组和RAPA组细胞TG含量显著降低(P<0.01)。与白藜芦醇组比较,3-MA+白藜芦醇组细胞TG含量显著升高(P<0.01)。

图2 白藜芦醇对FFAs诱导下AML-12细胞TG含量的影响。A.正常对照组 B.模型组 C.白藜芦醇组 D.RAPA组 E.3-MA组 F.3-MA+白藜芦醇组 G.Compound C组 H.Compound C+白藜芦醇组。

3）白藜芦醇对FFAs诱导下AML-12细胞脂滴堆积的影响

结果如图3所示,FFAs处理后的细胞内有大量红色脂滴,融合成片。白藜芦醇能显著减少细胞内的脂滴量,同时加入3-MA或CompoundC的组别脂质沉积无明显缓解。

图3 白藜芦醇对FFAs诱导下AML-12细胞脂滴堆积的影响(×400)A。正常对照组  B.模型组  C.白藜芦醇组 D.RAPA组  E.3-MA组  F.3-MA+白藜芦醇组G.CompoundC组  H.CompoundC+白藜芦醇组。

4）白藜芦醇对FFAs诱导下AML-12细胞凋亡的影响

结果如图4所示,正常细胞经AO染色发出绿色荧光,凋亡细胞经PI染色发出红色荧光。与正常对照组比较,模型组AML-12细胞凋亡明显增加,白藜芦醇组和RAPA组细胞凋亡明显减少。3-MA+白藜芦醇干预组和CompoundC+白藜芦醇干预组存活细胞较少,大部分细胞呈橙红色或橙黄色荧光。

图4白藜芦醇对FFAs诱导下AML-12细胞凋亡的影响(×200)A。正常对照组B.模型组C.白藜芦醇组D.RAPA组E.3-MA组F.3-MA+白藜芦醇组G.CompoundC组H.CompoundC+白藜芦醇组。

随后，还分析了白藜芦醇对FFAs 诱导下AML-12 细胞AMPK/ mTOR 信号通路相关蛋白表达的影响，白藜芦醇对FFAs诱导下AML-12细胞自噬相关蛋白表达的影响。

5.结论

NAFLD是21世纪全球医疗卫生的沉重负担,开发安全有效的药物势在必行。肝细胞内脂质代谢失衡导致甘油三酯(TG)异常积聚是NAFLD的病理基础,因此控制肝脏内脂质蓄积对于预防NAFLD至关重要。本研究结果显示白藜芦醇可明显改善FFAs诱导下肝细胞内脂滴积聚,细胞内TG含量的测定进一步支持了这一结果。

本研究结果显示白藜芦醇增加了FFAs诱导下AML-12细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1的表达,并降低了P62的表达,表明白藜芦醇可激活被抑制的自噬水平。此外,白藜芦醇还能明显减少肝细胞的凋亡。为了深入了解白藜芦醇在自噬和凋亡过程中的作用，本研究将3-MA或CompoundC与白藜芦醇共同作用于FFAs处理的AML-12细胞,实验结果显示白藜芦醇促进AML-12细胞的自噬水平及对脂代谢紊乱的调节作用被部分减弱,证明白藜芦醇通过激活自噬来减少肝细胞脂质蓄积。

小编有话说：

本文采用250μmol/L棕榈酸钠（SP）溶液联合500μmol/L油酸钠（SO）的游离脂肪酸(FFAs)溶液处理AML-12细胞48小时，成功建立肝细胞脂肪变性模型，诱导肝细胞脂质沉积和细胞凋亡。

上述实验条件和结果，可能会因加药时的细胞密度、代数、状态或耐药性的不同而有所区别。因此，建议具体实验中，先通过浓度、时间梯度实验，寻找出适合于所用细胞的最佳药物作用浓度和最佳作用时间，一般建议作用48-72小时。

参考文献

缪萍,卞尧尧,倪露露等. 白藜芦醇调控AMPK/mTOR信号通路改善游离脂肪酸诱导的AML-12细胞自噬功能和脂质代谢[J]. 中药材, 2024.