棕榈酸（钠）刺激人克隆结肠癌Caco-2细胞构建高脂膳食模式下的紧密连接蛋白损伤模型

棕榈酸（钠）刺激人克隆结肠癌Caco-2细胞构建高脂膳食模式下的紧密连接蛋白损伤模型

菌物学报（2024-11）

1. 前言

银耳Tremella fuciformis（TPs）属于真菌类担子菌门银耳科银耳属，是一种营养丰富、功能多元的食药用菌。从银耳子实体中分离纯化得到一种银耳多糖（TPs），能够干预葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎，同时能够激活Foxp3+T细胞，缓解肠道炎症，该银耳多糖还能显著增加肠道菌群多样性，恢复有益菌菌群相对丰度并结合菌群代谢物共同作用，达到干预结肠炎目的(Xuetal.2021)。

由于越来越多的研究表明紧密连接蛋白对干预消化道疾病和免疫疾病非常重要， 保持紧密连接的完整性并提高其表达水平可有效干预相关疾病的发展(Miner-Williams etal.2016；Zeiseletal.2019；Tilgetal.2020)，脂多糖、炎症因子、高脂饮食通过不同 机制都能导致肠道屏障受损(Lerner&Matthias2015；Lietal.2019；Ghezzaletal.2020)。 Geetal.(2020)分离纯化的银耳多糖能够缓解脂多糖诱导的Caco-2细胞屏障损伤，目前尚没有银耳多糖能否缓解高脂饮食诱导的肠道紧密连接受损方面的研究。棕榈酸 (palmiti cacid, PAd)人体内最常见的饱和脂肪酸，对人体不同器官有脂毒性，过量食用 PAd会破坏紧密连接完整性，并触发炎症反应导致肠道屏障功能障碍(Genseretal.2018； Ghezzaletal.2020)。

Ge所分离得到的银耳多糖和课题组前期分离的银耳多糖在单糖组成、连接方式、取代基类型方面均不同(Geetal.2020；Xuetal.2021)，为了进一步探究课题组制得的银耳多糖干预结肠炎是否是通过缓解肠道屏障损伤，本研究以PAd刺激人结肠癌上皮细胞Caco-2建立紧密连接蛋白损伤模型，分析该银耳多糖处理后对Caco-2细胞活力、完整性、炎症因子、抗氧化性、紧密连接蛋白及其相关调控信号通路的效果，探究银耳多糖影响肠道屏障的作用机制。

2. 高糖高脂细胞添加剂

文中高糖高脂细胞添加剂（棕榈酸钠、棕榈酸）源自西安鲲创科技发展有限公司（Xi'an Kunchuang Technology Development Co., Ltd）（货号KC001、KC003）。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、无菌、常温无析出、低温无析出、浓度精准，而且无需多次加热助溶，显著减少了操作步骤，提升了实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。

3. 细胞模型构建方法

人克隆结肠癌Caco-2细胞采用10%胎牛血清加1%青链霉素混合液培养，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。细胞贴壁生长，以1:3–1:5传代进行后续实验。

取对数生长期细胞，加入不同浓度银耳多糖，最终浓度分别为：25、50、100、200、400、600μg/mL，每组设5个复孔，在培养箱中培养24h后检测细胞活力。在Caco-2细胞分化21d之后，在上述细胞活力基础上进行加药处理，分别为：对照组（未处理组）、棕榈酸、棕榈酸+25μg/mLTPs、棕榈酸+50μg/mLTPs、棕榈酸+100μg/mLTPs、棕榈酸+200μg/mLTPs、棕榈酸+400μg/mLTPs、棕榈酸+600μg/mLTPs（棕榈酸作用浓度400μM）。置于37℃，5%CO₂的细胞培养箱中培养。

4.结果与分析

1）银耳多糖和棕榈酸对Caco-2细胞的毒性作用

当Caco-2细胞分别与不同浓度的TPs孵育24h后，细胞存活率均在98%以上(图1A)，说明TPs对Caco-2细胞没有毒性；当Caco-2细胞分别与不同处理组孵育24h后，细胞存活率均在96%以上（图1B），说明棕榈酸和银耳共同作用对Caco-2细胞没有毒性，选择棕榈酸和银耳共同作用下Caco-2细胞存活率最高（98%）的浓度：100μg/mLTPs、200μg/mLTPs、400μg/mLTPs继续开展实验。

2）银耳多糖对棕榈酸损伤Caco-2细胞完整性的影响

TEER值能够反映细胞单层完整性。由图1C可知，400μMPAd能够一定程度破坏细胞单层完整性，加入不同浓度TPs后细胞单层完整性有所提升，其中400μg/mL的TPs提升效果最好，达到1917.3Ω∙cm²，是PAd组TEER值的2.31倍，其次是200μg/mLTPs，达到PAd组TEER值的1.88倍。说明银耳多糖能够缓解PAd造成的Caco-2细胞完整性损伤。

图1  棕榈酸和银耳多糖对Caco-2细胞活力和完整性的影响A：不同浓度TPs对细胞活力影响；B：TPs和PAd对细胞活力影响；C：TPs和PAd对细胞完整性的影响.PAd组与CON组相比，p＜0.05标记#，p＜0.01标记##；Pad+TPs处理组与PAd组相比，p＜0.05标记*，p＜0.01标记**。

3）银耳多糖对Caco-2 细胞抗氧化性的影响

SOD、CAT、MDA值可以反映Caco-2细胞氧化状态，氧化还原平衡对维持肠道稳态、调控肠道炎症有重要作用(Campbell&Colgan2019)。经PAd处理后，抗氧化指标SOD和CAT降低、氧化指标MDA升高(图2)，说明PAd增加了Caco-2细胞的氧化程度。经TPs处理后，细胞氧化程度降低。200和400μg/mLTPs均能有效提升细胞抗氧化性能，且高剂量作用更明显。100、200和400μg/mLTPs都能显著降低Caco-2细胞氧化程度，200μg/mLTPs的作用最明显。

图2 银耳多糖对棕榈酸诱导的Caco-2细胞氧化性的影响A：CAT水平；B：SOD水平；C：MDA水平。

随后，还分析了银耳多糖对Caco-2细胞炎症因子表达的影响，银耳多糖对棕榈酸损伤紧密连接蛋白的影响，以及银耳多糖对Caco-2细胞炎症信号通路的影响。

5.结论

高脂饮食诱导的肥胖大鼠和小鼠肠道紧密连接蛋白occludin、claudin-1 等蛋白的 表达水平受到明显抑制(Suzuki & Hara 2010；Cremonini et al. 2019)，作为食物中常见 的饱和脂肪酸，摄入PAd 的小鼠肠道紧密连接蛋白也明显减少或易位，从而影响肠道 屏障功能(Xiao et al. 2017；Zhang et al. 2019；何亚伦等 2022)。细胞活力和完整性实 验结果表明暴露在PAd 和TPs 下不会对Caco-2 细胞产生毒性作用，PAd 能够损伤 Caco-2 细胞完整性，经TPs 处理可以减轻PAd 对细胞造成的损伤。TPs 能够调控肠道菌群及菌群代谢物(Xu et al. 2021)，而肠道菌群紊乱也会导致肠道屏障受损(雷棋怡等 2024)，目前发现TPs 可以干预PAd 导致的 肠道屏障受损，未来可进一步探究TPs 改变的肠道菌群是否对肠道屏障产生影响，从而更全面地说明TPs 对肠道屏障的作用。 

小编有话说：

本文采用400μM棕榈酸（PA）、24h刺激人结肠癌上皮细胞Caco-2成功构建高脂膳食模式下的紧密连接蛋白损伤模型，棕榈酸引发Caco-2细胞氧化应激反应并诱发了炎症，而银耳多糖处理能有效缓解由氧化应激诱发的炎症。

上述实验条件和结果，可能会因加药时的细胞密度、代数、状态或耐药性的不同而有所区别。因此，建议具体实验中，先通过浓度、时间梯度实验，寻找出适合于所用细胞的最佳药物作用浓度和最佳作用时间，一般建议在200-500 umol/L范围内、作用24-48小时。

参考文献

董茜，张仕林, 等.银耳多糖对肠道屏障的影响及作用机制[J]. 菌物学报, 2024.