棕榈酸BSA高脂细胞添加剂诱导小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）建立高脂细胞模型

棕榈酸BSA高脂细胞添加剂诱导小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）建立高脂细胞模型

王新宇/吉林大学/博士论文

1. 前言

力学刺激是骨生长和骨重建过程中重要的调节因素。低载荷高频率机械振动 （Low‑magnitude high‑frequency vibration, LMHFV）作为力学刺激的一种。目前，研究发现LMHFV可以改善肥胖患者的胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱。但是，LMHFV能否改善肥胖所致骨质疏松尚未有明确报道。因此本研究将LMHFV作为肥胖所致骨质疏松的治疗手段。探究LMHFV改善肥胖所致骨质疏松的力学生物学机制，为临床治疗肥胖所致骨质疏松提供理论依据和实验基础。

2.实验材料

本文以小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）为对象，采用棕榈酸BSA高脂细胞添加剂（KC004，Kunchuang Biotechnology）作为游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs），完成体外细胞实验。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、常温无析出、浓度精准，而且无需多次加热助溶，显著减少了操作步骤，提升了实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。

3. 实验方法

1）向培养MC3T3-E1 细胞的完全培养基中加入棕榈酸（Palmitic acid, PA）模拟肥胖患者体内高脂环境。对PA 处理的MC3T3-E1 细胞施加LMHFV 构建体外治疗模型。

实验分组如下：

不同浓度的PA（0.25 mM 和0.5 mM）分组。使用PA 处理体外MC3T3-E1 细胞，模拟肥胖患者体内高脂环境。对照（Con）组：用正常的完全培养基培养 MC3T3-E1 细胞。

转录组测序分组。对照（Con）组：用正常的完全培养基培养MC3T3-E1 细 胞。PA 组：将PA 添加到完全培养基中，使PA 浓度最终是0.5 mmol/L。PA+LMHFV 组：在完全培养基中添加PA使其浓度为0.5 mmol/L，施加持续30 分钟的LMHFV。

2）CCK-8 法测定MC3T3-E1 细胞的活性和增殖情况。使用流式细胞术检测细胞凋亡。

3）碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）染色检测MC3T3-E1 细胞的ALP 活性。

4）茜素红S（Alizarin Red S, ARS）染色检测MC3T3- E1 细胞矿化结节的数量和形成能力。

5）蛋白质免疫印迹（Western blot, WB）技 术测定MC3T3-E1 细胞中成骨相关蛋白的表达量。

6）对实验的不同组别进行转录组测序，筛选差异表达基因（Differentially expressed genes, DEGs）；使用功能富集分析筛选出和DEGs 密切相关的核心通路；将组间的DEGs 取交集，通过蛋白质网络相互作用方法筛选出高脂环境下LMHFV 对MC3T3-E1 细胞起作用的核心分子。

7）使用小干扰RNA（Small interfering RNA, siRNA）构建整合素β1 （Integrin beta 1, ITGβ1）敲低细胞模型。

4.实验结果分析

1）高脂环境抑制MC3T3-E1细胞增殖及活性

分别加入不同浓度的PA（0.25mM和0.5mM）处理MC3T3-E1细胞24小时，随后使用CCK-8试剂盒检测MC3T3-E1细胞增殖及活性。与Con组相比，0.25mM PA和0.5mM PA处理MC3T3-E1细胞24小时后，均明显抑制细胞增殖，细胞活性降低（p<0.05）。

图1 高脂环境抑制MC3T3-E1细胞的增殖及活性

2）高脂环境促进MC3T3-E1细胞凋亡

使用细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞仪分析不同浓度的PA（0.25mM和0.5mM）对MC3T3-E1细胞凋亡的影响。与Con组相比，0.25mM PA和0.5mM PA均明显促进MC3T3-E1细胞凋亡，凋亡细胞比例显著增加（p<0.05）。

图2高脂环境促进MC3T3-E1细胞的凋亡。

（A）流式细胞仪荧光强度散点图。（B）凋亡细胞百分比。

3）高脂环境抑制Runx2、COL1和Osterix蛋白的表达

分别使用不同浓度的PA（0.25mM和0.5mM）处理MC3T3-E1细胞，并通过Western Blot检测与MC3T3-E1细胞增殖分化相关的Runx2、COL1和Osterix蛋白的表达（结果见图3.3）。与Con组相比，0.25mMPA和0.5mMPA均明显抑制MC3T3-E1细胞Runx2、COL1和Osterix蛋白的表达（p<0.05）。与0.25mMPA组相比，0.5mMPA组显著抑制了MC3T3-E1细胞Runx2、COL1和Osterix的蛋白表达（p<0.05）。研究结果表明，高脂环境下，成骨细胞增殖分化相关蛋白（Runx2、COL1和Osterix）的表达水平受到抑制，并且随着PA浓度的增加，这种抑制作用更为显著。

图3高脂环境抑制MC3T3-E1细胞成骨相关蛋白的表达。（A,B）WesternBlot检测COL1、Runx2和Osterix蛋白的相对表达量。

此外，还发现高脂环境抑制MC3T3-E1细胞的分化、高脂环境抑制MC3T3-E1细胞的矿化等。根据上述实验结果分析，相较于0.25mM浓度的PA，0.5mM浓度的PA对MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化抑制作用更加显著，且能明显促进其凋亡。因此，后续实验使用0.5mM浓度的PA模拟体内高脂环境。

随后，作者进行了多个实验，证明LMHFV 改善高脂环境下MC3T3-E1 细胞的生物学行为。例如：LMHFV改善高脂环境对MC3T3-E1细胞增殖及活性的抑制作用、LMHFV改善高脂环境对MC3T3-E1细胞的促凋亡作用等。

小编有话说：

本文采用0.5mM棕榈酸（PA）处理MC3T3-E1细胞，模拟肥胖患者体内高脂环境，24h后，实验结果表明棕榈酸（PA）对MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化有明显抑制作用，且能促进其凋亡。本研究为肥胖所致骨质疏松的治疗提供了一个很好的细胞模型，具有一定的参考价值。

参考文献

王新宇. 低载荷高频率机械振动改善肥胖所致骨质疏松的力学生物学机制研究，博士论文，2024(5).