棕榈酸诱导LO2细胞损伤与炎症反应以建立MAFLD体外细胞模型

棕榈酸诱导LO2细胞损伤与炎症反应以建立MAFLD体外细胞模型

—许云春/实用医学杂志

1. 前言

代谢相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）是以肝细胞内脂质过度蓄积、炎症反应以及氧化应激为特征的一种常见的肝脏疾病，并可发展为更加严重的肝硬化甚至肝癌等终末期肝病，其发病率呈逐年上升趋势。MAFLD受多重因素影响，脂毒性肝损伤和炎症反应是其发病机制中最为重要的驱动因素，NF-κB信号传导途径在受损的肝细胞中被激活并诱导炎症细胞因子分泌，加速疾病进展，抑制NF-κB信号通路的激活可能成为减轻MAFLD中肝细胞炎症损伤的关键。

有研究表明沉默lncRNA NEAT1通过抑制TLR2/NF-κB信号通路的激活来改善脂多糖诱导的小鼠心肌损伤和炎症。然而，lncRNA NEAT1是否可以通过调控NF-κB信号通路来影响MAFLD中肝细胞损伤及炎症反应目前尚不明确，因此，探究其可能存在的调控机制可为MAFLD的诊治提供新见解。

本研究以棕榈酸（PA）处理人正常肝永生化细胞株（LO2）建立MAFLD 体外细胞模型，通过脂质体转染实现过表达或者沉默lncRNA NEAT1，探讨其表达水平变化对棕榈酸诱导的LO2 细胞损伤与炎症反应的影响，并初步阐明其机制。

2.材料

棕榈酸（棕榈酸酯）及高脂溶剂对照，均购自西安鲲创科技发展有限公司。该试剂常温无析出、浓度准确，无需加热助溶。利用商品化的细胞用高脂细胞添加剂，母液含有高浓度的游离脂肪酸，由于试剂本身为液态、无菌，能与完全培养基直接互溶用于实验，减少了旧方案使用乙醇、NaOH等助溶剂（助溶剂本身有细胞毒性，混杂了高脂试剂的作用）和溶解时的加热操作，节省了操作，增强了实验的稳定性。

3.方法

3.1细胞培养、模型建立及分组

使用含10% 胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM培养基培养LO2 细胞，并将其置于37℃、5% CO₂的培养箱，当细胞密度达80% ~ 90%时，消化传代。取对数生长期的细胞进行实验，分为Blank组（空白对照），Vehicle组（溶剂对照），PA组（模型组：添加0.32 mmol/L棕榈酸处理24 h）。设置Control 组（阴性对照组）、PA 组（模型组）、pcDNA-NC+PA 组（过表达空载对照组）、pcDNA-NEAT1+PA 组（过表达组）、si-NC+PA 组（沉默阴性对照组）、si-NEAT1+PA组（沉默组）。

3.2油红O染色和甘油三酯（TG）含量测定评估细胞脂质积累

油红O染色按照以下步骤进行，细胞处理后，4%多聚甲醛固定30min，60%异丙醇润洗后使用油红O工作液避光染色30 min，60% 异丙醇洗涤后苏木素染液染色2min，显微镜观察获取图像。TG含量测定根据试剂盒说明书进行操作，收集细胞进行裂解，使用酶标仪检测波长为550 nm处的吸光度值并根据标准曲线计算TG浓度，再通过BCA法测定细胞内蛋白浓度，以蛋白浓度校正TG含量。

3.3CCK8检测细胞活力

取对数生长期的 LO2细胞接种于96孔板中，分组处理后，每孔加入 CCK8溶液10 μL，37℃避光孵育1 h后使用酶标仪检测OD450，细胞活力=［（OD 实验组-OD 空白组）/ （OD 对照组-OD 空白组）］×100%。

随后，利用丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）酶活力测定反映肝细胞损伤，再利用实时荧光定量PCR（qPCR）检测各目的基因mRNA水平，再利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测炎症因子蛋白分泌水平，最后，利用蛋白质印迹（WB）和免疫荧光（IF）检测 NF-κB 信号通路相关蛋白表达。其中，实验数据采用GraphPadPrism9.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

4.结果

4.1 棕榈酸处理对LO2细胞损伤与炎症反应的影响

与Blank组相比，Vehicle组溶剂处理对LO2细胞脂质积累、细胞活力、细胞损伤、炎症因子表达变化均无统计学意义（P>0.05）；而PA组棕榈酸处理后LO2细胞内脂质明显积累，细胞活力降低，肝细胞损伤指标ALT、AST酶活性增高，炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达升高（P<0.01）。见图1。

4.2 棕榈酸处理对LO2细胞中lncRNA NEAT1表达水平的影响

与Blank组相比，Vehicle组溶剂 对照处理对lncRNA NEAT1表达无影响（P>0.05），PA组棕榈酸处理后lncRNA NEAT1表达增高（P< 0.01），见图2。

4.3 过表达及沉默lncRNA NEAT1转染效果的检测

结果显示，与过表达空载对照组（pcDNA-NC+PA）相比，过表达组（pcDNA-NEAT1+PA）lncRNA NEAT1表达水平进一步增高，与沉默阴性对照组（si-NC+PA）相比，沉默组（si-NEAT1+PA）lncRNA NEAT1表达降低，提示过表达及沉默均成功（P<0.01），见图3。

4.4 过表达及沉默lncRNA NEAT1对棕榈酸诱导的LO2细胞损伤与炎症反应的影响

结果显示，与过表达空载对照组（pcDNA-NC+PA）相比，过表达组（pcDNA-NEAT1+PA）细胞活力显著降低，肝损伤指标ALT、AST和炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达进一步增高；与沉默阴性对照组（si-NC+PA）相比，沉默组（si-NEAT1+PA）细胞活力有所恢复，肝损伤指标、炎症因子水平均下调（P<0.05）。

4.5 过表达及沉默lncRNA NEAT1对棕榈酸诱导的LO2细胞中NF⁃κB信号通路的影响

与Control组相比，PA组棕榈酸处理后NF-κB信号通路被激活，NF-κB抑制蛋白IKBα降解，NF-κB p65的磷酸化及核转位增加。与过表达空载对照组（pcDNA-NC+PA）相比，过表达lncRNA NEAT1后进一步促进二者变化。与沉默阴性对照组（si-NC+PA）相比，沉默lncRNA NEAT1则提高了IKBα的表达并减少NF-κB p65的磷酸化及核转位。

5讨论

在MAFLD中，肝脏脂质沉积过多导致脂质代谢紊乱，在长期慢性的脂毒性刺激下，肝细胞出现应激性损伤，肝脏表现出严重的炎症反应，伴随氧化应激增强，炎症介质增加，肝细胞损伤进一步加重。因此，探究能够改善肝细胞损伤和炎症反应等病理生理过程的策略对缓解MAFLD的发展尤为重要。越来越多的lnc RNA被发现在疾病过程中异常表达，它们已被广泛建议作为某些病理环境中的生物标志物和治疗靶点，对临床诊断及疗效判定等方面具有重要价值。LncRNA NEAT1作为其中的一种，被证实与多种肝脏疾病的发病以及病情进展有关，它能够加速肝纤维化和肝细胞癌的进展，同时通过调节炎症反应在急慢性肝衰竭的发病机制中发挥保护作用。然而，在MAFLD中lncRNA NEAT1是否发挥调节肝细胞损伤和炎症反应的作用尚未被阐明。因此，本文就上述问题进行分析。

对于该病的研究，使用棕榈酸处理LO2细胞构建体外细胞模型已被充分报道与证实。其中，油红O染色和甘油三酯含量测定是反映肝细胞脂质积累的常用方法，也是用于指示建模成功的关键指标；ALT、AST则是反映肝细胞损伤和判断损伤程度的酶；TNF-α、IL-1β、IL-6作为经典的炎症细胞因子，其表达增加与肝脏炎症状态相关。本研究采用棕榈酸诱导LO2细胞建模，与预期结果一致，处理后细胞脂质沉积，甘油三酯含量增加，还存在肝细胞损伤和炎症反应，说明MAFLD细胞模型构建成功。在此基础上，检测lncRNA NEAT1在棕榈酸诱导后的表达变化，发现其表达上调，且与肝细胞损伤和炎症因子表达呈正相关，提示lncRNA NEAT1可能是棕榈酸诱导的肝细胞损伤中的重要调控分子。进一步过表达或沉默lncRNA NEAT1对其进行功能研究，发现过表达该分子加剧棕榈酸诱导的细胞损伤和炎症反应，沉默该分子后可以缓解上述损伤，以上结果表明，lncRNA NEAT1在棕榈酸诱导的肝细胞损伤与炎症反应中发挥重要作用。

肝细胞炎症反应是导致MAFLD疾病进展的关键因素之一，NF-κB信号通路的激活在其中发挥重要作用，静息状态下NF-κB由p65和p50与其抑制蛋白（inhibition of NF-κB，IκB）结合形成三聚体以无活性形式存在于肝细胞胞浆中，受到刺激时IκB被降解，释放出的NF-κB p65亚基在胞质中被激活，然后磷酸化移位进入胞核诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等多种促炎基因的表达。在本研究中发现，棕榈酸诱导的肝细胞中，NF-κB抑制蛋白IκBα被降解，释放出的NF-κB p65磷酸化入核增多，提示脂毒性损伤状态下，NF-κB炎症信号通路被激活。推测NF-κB信号通路的激活和异常表达的lncRNA NEAT1可能存在联系，具体调控关系尚不明确。先前的研究表明lncRNA NEAT1通过正调节NF-κB信号通路促进化脓性小鼠的脑损伤和细胞凋亡与炎症；lncRNA NEAT1/miR-193a-3p通过影响TLR4/NF-κB信号通路来调节脂多糖诱导的细胞凋亡和炎症损伤；抑制NEAT1的表达通过减少NF-κBp65的细胞核转位来保护大鼠心肌缺血再灌注损伤，这些都为阐明lncRNA NEAT1能够调控NF-κB信号通路提供了有力依据。本研究同样证明，过表达lncRNA NEAT1可以进一步促进NF-κB信号通路的激活，加剧肝细胞损伤，促进炎症因子的表达，沉默lncRNA NEAT1可以减少该通路的激活，下调肝细胞损伤指标和炎症因子。以上结果证实，沉默lncRNA NEAT1可通过抑制NF-κB信号通路的激活来减轻肝细胞损伤与炎症反应，从而在MAFLD中发挥保护作用。

综上所述，本实验初步证实了lncRNA NEAT1 与棕榈酸诱导的肝细胞损伤及炎症反应密切相关，且首次验证了沉默lncRNA NEAT1 通过抑制 NF-κB信号通路的激活来改善上述损伤。但本研究仅在体外细胞模型中得到验证，并且lncRNA NEAT1调控NF-κB信号通路还可能是通过海绵化下游靶miRNA来发挥作用，本课题组下一步将深入研究lncRNA NEAT1的具体调控机制并在动物模型中补充论证，以期为代谢相关脂肪性肝病的诊治提供更为可靠的实验依据。

小编有话说：

本文采用0.32 mmol/L棕榈酸（KC004，西安鲲创科技）处理的LO2细胞24h，处理后脂质含量增加，细胞活力降低，肝细胞损伤指标ALT、AST酶活性升高，炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达增加，同时lncRNA NEAT1表达上调，成功诱导LO2细胞损伤与炎症反应、并建立MAFLD体外细胞模型。进一步的研究工作，推荐油酸钠、棕榈酸钠（KC006）联合建立HepG2、LO2脂肪肝细胞模型。

参考文献

许云春、于馨雅等. LncRNA  NEAT1调控NF-κB信号通路对棕榈酸诱导的LO2细胞损伤与炎症反应的影响[J]. 实用医学杂志, 2023.