高脂环境下（游离脂肪酸FFA、PA、OA）对肝癌细胞（HepG2）E2F1的影响

—王潇/广西医科大学

1. 前言

原发性肝细胞癌（简称为肝癌）及代谢相关脂肪性肝病 （Metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）均为临床上常见的疾病，研究表明高脂饮食与MAFLD 和肝癌的发生发展有密切关系。而肝癌发生转移后，患者的生存率大幅度下降。而在肝癌细胞的侵袭迁移中上皮间质 转化（Epithelial-Mesenchymal，EMT）发挥着重要作用。本课题的前期研究表明，在高糖条件下，Huh-7 肝癌细胞中过表达的E2F 转录因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）可促进细胞发生EMT。但高脂对E2F1的影响尚不明确，高脂环境中肝癌细胞中E2F1 与EMT 之间的关系也不明确。因此，本研究将探讨高脂对肝癌细胞E2F1 的影响，以及高脂条件下肝癌细胞 E2F1 与EMT 的相关关系及高脂促进肝癌细胞侵袭转移的可能的分子机制。

2.方法

1.观察高脂条件下HepG2肝癌细胞侵袭、迁移能力的变化：根据培养基是否含游离脂肪酸（Free fat acid,FFA）分为对照组和高脂组(1mmol/LFFA,其中油酸(Oleicacid,OA)与棕榈酸（Palmiticacid，PA）的比例为2：1)，分别用这两种培养基培养HepG2肝癌细胞。随后，用划痕实验和Transwell迁移实验来比较两组细胞的迁移能力，而两组细胞的侵袭能力则通过Trasnwell侵袭实验来比较。

2.探讨高脂条件下HepG2肝癌细胞中E2F1和EMT相关标志物的表达情况：将HepG2肝癌细胞分别用对照组培养基和高脂组培养基处理24小时。两组细胞中E2F1和EMT相关标志物（α-SMA、Vimentin、β-catenin、E-cadherin）的蛋白表达通过WesternBlot实验检测；两组细胞中E2F1和EMT相关标志物的mRNA水平则通过qPCR实验检测。

3.探讨E2F1与EMT相关标志物的相关关系：用Spearman相关分析E2F1与EMT相关标志物的相关关系。

3.材料

实验用棕榈酸钠/油酸钠试剂盒（KC006）购自西安鲲创科技有限公司，其中：棕榈酸钠和油酸钠具有常温无析出、浓度准确，无需加热助溶等特点。利用商品化的细胞用高脂细胞添加剂，母液含有高浓度的游离脂肪酸，由于试剂本身为液态、无菌，能与完全培养基直接互溶用于实验，减少了旧方案使用乙醇、NaOH等助溶剂（助溶剂本身有细胞毒性，混杂了高脂试剂的作用）和溶解时的加热操作，节省了操作，增强了实验的稳定性。

4.试剂配置方法

1） 1mmol/L FFA 培养基的配制

将10mL 离心管、离心管架、酒精灯、封口膜、无粉橡胶手套、各种型号的巴氏吸管、吸头及微量加样枪等 置于超净台上，打开紫外线灯照射半个小时以上。消毒完毕后，用1000μL 微量加样枪吸取300μL 的FBS 加入15mL 离心管内，然后更换新的吸头后分别吸取100μL 的20mmol/L OA 和10mmol/L PA 于同一离心管内，最后加入1g/L DMEM 不完全培养基将溶液配制到5mL,用巴氏吸管将溶液轻柔吹 打混匀，此时尽量不要让溶液产生气泡。用封口膜封口，在离心管上标注 好配置时间，试剂名称等，放入4℃冰箱保存，保质期为一周。

2）对照组培养基的配制

前期步骤与上述步骤相同，用1000μL微量加样枪吸取200μL对照试剂于离心管内，加入1g/LDMEM不完全培养基将溶液配制到5mL,用巴氏吸管将溶液轻柔吹打混匀，此时尽量不要让溶液产生气泡。用封口膜封口，在离心管上标注好配置时间，试剂名称等，放入4℃冰箱保存，保质期为一周。

5.结果

1）高脂对HepG2肝癌细胞侵袭能力的影响

将经过高脂组和对照组培养基处理24h后的HepG2肝癌细胞接种于Transwell小室中，小室中细胞密度为1*10⁵个/mL，24h后得到高脂对HepG2肝癌细胞侵袭能力的影响的结果。Transwell侵袭实验结果显示高脂组的细胞侵袭数目明显多于对照组（P＜0.05)。

2）高脂对HepG2肝癌细胞E2F1表达的影响

HepG2肝癌细胞分别在对照组和高脂组培养基中培养24h后提取细胞总蛋白质，用WesternBlot的实验方法检测两组细胞中E2F1的蛋白质含量，用ImageJ软件对蛋白条带的灰度值进行分析。结果显示高脂条件下，细胞中E2F1的相对蛋白表达量较对照组明显升高（P＜0.05）。用qPCR的实验方法测定两组细胞中E2F1mRNA的表达水平，结果提示，高脂条件下细胞中E2F1的mRNA水平较对照组明显升高（P＜0.05）。

3）高脂条件下HepG2肝癌细胞EMT相关标志物的表达

HepG2肝癌细胞分别在对照组和高脂组培养基中培养24h后提取细胞总蛋白质，用WesternBlot的实验方法检测两组细胞中EMT的蛋白质含量，用ImageJ软件对蛋白条带的灰度值进行分析。结果显示高脂条件下，细胞中α-SMA、Vimentin、β-catenin的相对蛋白表达量较对照组明显升高，E-cadherin较对照组明显降低（P＜0.05）。用qPCR的实验方法测定两组细胞中α-SMA、Vimentin、β-catenin、E-cadherinmRNA的表达水平，结果提示，高脂条件下细胞中α-SMA、Vimentin、β-catenin的mRNA水平较对照组明显升高（P＜0.05），E-cadherin的mRNA水平较对照组明显降低（P＜0.05）。

5结论

本研究中通过体外培养HepG2 肝癌细胞发现了高脂能促进细胞中 E2F1 的表达， E2F1 与α-SMA、Vimentin、β-catenin 呈正相关关系,与 E-cadherin 呈负相关关系。为下一步研究E2F1 与Wnt/β-catenin 信号通路在HepG2 肝癌细胞发生发展中的作用提供理论基础。但在高脂条件下，过表达的E2F1 是否通过激活Wnt/β-catenin 信号通路来促进HepG2 肝癌细胞发生EMT 过程，并增强其侵袭迁移能力仍需进一 步研究。后续可通过沉默HepG2 肝癌细胞中E2F1，检测Wnt/β-catenin 信号通路、EMT 相关标志物和细胞侵袭迁移能力的变化来探讨高脂条件下 HepG2 肝癌细胞发生EMT 的具体分子机制。

最后得出，高脂可促进HepG2细胞中E2F1的表达，可诱导HepG2肝癌细胞发生EMT并增强细胞的侵袭迁移能力。本研究结果提示在临床上应积极指导患者及时降低血脂，避免发展为MAFLD或肝病恶化，减轻病情。

参考文献

王潇. 高脂条件下HepG2肝癌细胞的E2F1与EMT的相关关系研 [D].广西医科大学, 2021(5).