体外高脂环境（棕榈酸BSA）（棕榈酸溶液）对牙周膜干细胞（PDLSCs）影响研究
本研究使用200μM棕榈酸（PA）处理14天，可显著抑制PDLSCs的成骨分化潜能，为肥胖患者牙周组织再生治疗提供了一个体外研究模型。
体外高脂环境（棕榈酸BSA）（棕榈酸溶液）对牙周膜干细胞（PDLSCs）影响研究
—曲红蕾/高脂环境中lncRNA AC018926.2对牙周膜干细胞成骨分化调控作用的研究
1. 前言
肥胖作为脂肪过度积累的全身慢性炎症状态，因对几乎所有的人体系统产生影响而增加了相关疾病的发病率和死亡率。了解肥胖影响牙周炎的机制有助于我们进一步阐释肥胖与牙周炎的复杂关系，并且为改善肥胖患者的牙周治疗效果找到新的突破口。
对于牙周炎导致的组织缺损，使已经丧失的牙槽骨得到恢复，是治疗牙周炎和实现牙周组织再生的关键。无论是内源性再生还是外源性再生，牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）都因其优越的增殖能力和多向分化潜能，被视为牙周组织再生的重要种子细胞，同时，PDLSCs的分化是一个许多因素参与的复杂过程，在一些特殊条件下，如缺氧、炎症、高糖等，PDLSCs的多向分化潜能则会受到损伤。肥胖状态的一项特征是全身和局部脂肪酸（fatty acids, FAs）水平升高，一些特定的FAs类型具有促炎作用，可加重局部炎症反应和骨破坏，影响骨愈合。
然而，FAs对牙周组织修复过程中的这一重要细胞—PDLSCs成骨分化的影响及其机制的相关研究仍然不够充分。我们推测高脂环境可抑制PDLSCs的成骨分化潜能，而通过调控相关分子通路来改善高脂环境中PDLSCs的骨形成能力，可能是提高肥胖患者牙周组织再生治疗效果的一条重要途径，也是本研究拟解决的一个关键问题。
目前已发现 lncRNAs 可以在生理和病理情况下，通过多种机制在转录、转录后及表观遗传水平调节基因表达，从而正向或负向调控PDLSCs 的成骨分化。为了深入探究高脂环境中lncRNAs对PDLSCs成骨分化的调控作用，本研究使用棕榈酸（palmicacid, PA）构建高脂环境，系统观察了PDLSCs的成骨分化潜能在高脂环境中的改变；同时识别并验证了lncRNA AC018926.2在高脂环境导致的PDLSCs成骨功能降低的过程中发挥重要作用。在机制上，高脂环境中下调的AC018926.2通过在转录水平上调控ITGA2的表达而抑制ITGA2/FAK/PI3K/AKT信号通路，进而影响PDLSCs的成骨分化，并且AC018926.2调控ITGA2表达的方式可能是通过与PARP1蛋白结合实现的。
2.实验材料
实验用棕榈酸溶液（KC004）购自西安鲲创科技有限公司/鲲创生物科技部，其中：棕榈酸具有常温无析出、浓度准确，无需加热助溶等特点。利用商品化的细胞用高脂细胞添加剂，母液含有高浓度的游离脂肪酸，由于试剂本身为液态、无菌，能与完全培养基直接互溶用于实验，减少了旧方案使用乙醇、NaOH等助溶剂（助溶剂本身有细胞毒性，混杂了高脂试剂的作用）和溶解时的加热操作，节省了操作，增强了实验的稳定性。
3. 体外高脂环境对PDLSCs成骨分化潜能的影响
1）实验方法
为了明确高脂环境对PDLSCs成骨分化的影响，我们在对PDLSCs进行成骨诱导的同时，将其分为两组，根据以往多数类似研究所采用的PA浓度，实验组成骨诱导液中加入PA使其终浓度为200μM，记为PA组，对照组成骨诱导液中加入等量对照溶剂（成分为不含FAs的牛血清白蛋白，bovine serum albumin,BSA），记为Ctrl组，隔2天换液。
具体的，本研究利用200μM的PA构建高脂培养环境，以模拟肥胖患者的牙周局部微环境，对照组加入同等浓度的牛血清白蛋白（FA-free bovine serum albumin,BSA），在成骨诱导条件下培养PDLSCs，通过qRT-PCR和Westernblot实验检测成骨相关基因和蛋白的表达水平，通过ALP和茜素红染色及定量检测ALP活性和矿化结节形成能力，从而系统地观察高脂环境中PDLSCs成骨分化潜能的变化。
2）实验结果
（1）PA 处理7 天对PDLSCs 成骨分化无明显影响
首先我们利用qRT-PCR技术和Westernblot实验分别检测了PA处理7天时，Ctrl组和PA组中PDLSCs成骨相关基因COL1、ALP、RUNX2、BMP2和OCN以及成骨相关蛋白COL1、ALP、RUNX2和BMP2的表达情况，结果显示，与Ctrl组的PDLSCs相比，以上基因和蛋白中，仅COL1的基因水平和RUNX2的蛋白水平在PA组的PDLSCs中显著降低（图1.2.1），而其余分子则未发生明显变化，提示在PA环境下培养7天对PDLSCs成骨分化无显著影响。
（2）PA处理14天显著抑制PDLSCs的成骨分化潜能
接下来我们使用同样的实验方法检测了PA处理14天对PDLSCs表达成骨相关基因COL1、ALP、RNUX2、BMP2和OCN以及成骨相关蛋白COL1、ALP、RUNX2和BMP2的影响，发现以上基因的表达水平均在PA组的PDLSCs中显著降低，同时PA组中的PDLSCs表达成骨相关蛋白COL1、RUNX2和BMP2的水平也明显低于Ctrl组中的PDLSCs，而ALP的表达量在两组之间的差别虽无统计学意义，但是也表现为在PA组中降低的趋势（图1.2.2），这提示在PA环境中培养14天对PDLSCs成骨相关基因和蛋白具有抑制作用。
ALP染色结果也表明，与Ctrl组相比，PA组中PDLSCs明显着色更浅，ALP 染色阳性的细胞少于Ctrl组。与染色结果相同，ALP定量结果也表明，经过PA处理后，PDLSCs的ALP活性显著降低（图1.2.3）。
同样地，对PDLSCs成骨诱导21天后的茜素红染色结果显示，PA组中的PDLSCs形成的矿化结节少而稀疏，在对矿化结节进行定量检测后也发现，PA环境可显著抑制PDLSCs矿化结节的形成（图1.2.4）。
3）实验讨论
既往研究结果存在的差异可能在一定程度上与不同的PA处理时间有关，因此，在本研究中，我们使用PA对PDLSCs分别处理了7天和14天两个时间段，并通过一系列实验系统、全面地观察了PDLSCs的成骨分化潜能在PA环境中的改变，发现PA处理14天后的PDLSCs成骨相关基因和蛋白的表达水平显著下降，ALP活性降低、矿化结节的形成也明显减少，表明在PA环境中培养14天可抑制PDLSCs的成骨分化潜能，因此在接下来的实验中将继续采取14天的处理时间。考虑到肥胖是一种慢性状态，我们认为与以往多数研究中的6-8天的培养方案相比，更长的PA暴露时间（本研究中采用的时间为至少14天）是有必要的，可以更好地模拟肥胖患者的实际情况。在明确了PA对PDLSCs成骨分化可产生负面影响后，我们在下一步实验中将继续对其中的深入机制进行探索，希望能够提供在高脂环境中逆转PDLSCs生物学性能的关键靶点。
随后作者进行了高脂环境中PDLSCs 差异表达lncRNAs 的筛选及lnc-AC018926.2 的确定，具体完成了高脂环境中PDLSCs差异表达lncRNAs的筛选与分析、成骨相关lncRNAAC018926.2的确定及其对PDLSCs成骨分化的影响、AC018926.2调控PDLSCs成骨分化的机制研究、AC018926.2 下游分子及信号通路的筛选、分析与验证等工作，详情见原文。
5.结论
我们的研究识别并验证了lncRNA AC018926.2在高脂环境导致的PDLSCs成骨功能降低的过程中发挥重要作用。高脂环境中下调的AC018926.2通过在转录水平上调控ITGA2的表达而抑制ITGA2/FAK/PI3K/AKT信号通路的活性，进而影响PDLSCs的成骨功能，并且AC018926.2调控ITGA2表达的方式可能是通过与PARP1蛋白结合实现的（如下图所示）。
这些发现揭示了AC018926.2是高脂环境中PDLSCs成骨分化的重要调节因子，并且可能成为肥胖患者牙周炎的治疗靶点。本研究为通过调控lncRNAs表达改善高脂环境中受损的干细胞分化潜能提供了理论依据，为提高肥胖患者牙周组织再生治疗提供了一条重要途径，为进一步改善牙周再生治疗的手段和效果奠定了基础。然而需要指出的是，本研究的结论建立在体外实验的基础上，但在动物体内的微环境中AC018926.2是否同样发挥调控成骨分化的功能，需要进一步研究论证，在未来工作中，我们将针对这一问题继续进行探索。
小编有话说：
本研究使用200μM棕榈酸（PA）处理14天，可显著抑制PDLSCs的成骨分化潜能，为肥胖患者牙周组织再生治疗提供了一个体外研究模型。
参考文献
