Bone Research（IF/ 15）：使用油酸和棕榈酸构建原代肝细胞脂肪变性模型以研究“脂肪肝-骨髓脂肪-软骨”跨器官通讯轴

1. 研究背景

本文聚焦于骨关节炎（OA）的跨器官调控机制，指出衰老与代谢紊乱通过“代谢性炎症”和“炎症性衰老”驱动关节退变。现有治疗多局限于关节内注射，尚缺乏能够改变疾病进程的药物疗法。近年研究揭示了“肝脏－骨髓脂肪组织－软骨”轴的重要性，但骨髓脂肪组织（MAT）与肝脏在OA中的协同作用尚不明确。补体系统作为先天免疫枢纽，其替代途径的过度激活已被证实参与软骨损伤，但上游来源和下游效应仍存空白。本研究创新性地揭示雌激素相关受体α（ESRRA）在骨髓脂肪细胞（BMAds）中转录调控补体因子D（CFD），而脂肪肝释放大量补体C3，二者通过C3-CFD-MAC（膜攻击复合物）级联放大，激活ERK1/2磷酸化及线粒体功能障碍，促进软骨细胞衰老与分解代谢。靶向ESRRA可同时抑制MAT扩张和MAC沉积，为衰老性及代谢性OA提供新治疗思路。

2. 技术路线

首先，构建了脂肪细胞特异性Esrra敲除（EsrraA KO）小鼠，并在自然衰老模型及高脂高胆固醇饮食联合手术诱导的实验性OA模型中开展验证，通过转录组、ChIP-qPCR、荧光素酶报告基因明确CFD为ESRRA直接靶基因。体内外实验证实BMAds来源的CFD与肝源性C3协同激活补体，并利用ESRRA拮抗剂（穿心莲内酯，AP）和CFD抑制剂（Danicopan）验证药理学阻断效果。

其次，在细胞实验层面，分离小鼠原代BMSCs诱导成脂分化，获取BMAds条件培养基（CM），处理原代软骨细胞或人C28/I2细胞，并联合重组C3或胆固醇/脂肪酸处理的原代肝细胞进行Transwell共培养。通过免疫印迹、免疫荧光、线粒体染料、β-半乳糖苷酶染色及Seahorse呼吸测定，系统评估软骨细胞表型、线粒体功能与衰老标志。

3. 高脂细胞添加剂

在体外细胞实验中，使用250 μmol/L油酸和125 μmol/L棕榈酸（Kunchuang Biotechnology #KC003）混合处理原代肝细胞24小时，模拟脂质过载状态，构建肝细胞脂毒性应激模型，成功诱导C3高表达和分泌，证实肝细胞是代谢应激下C3的重要来源。

本实验使用的关键试剂如下：棕榈酸高脂细胞添加剂（货号KC003）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸以及溶剂对照，具有如下显著优点：该添加剂为无菌液体溶液，浓度准确，可以直接按比例加入细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。该添加剂的溶剂无毒，配制过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。该添加剂低温无析出、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

此外，针对HepG2、AML12、HHL5人胚胎肝细胞系、原代肝细胞、LX-2肝星状细胞等多种肝细胞，推荐使用棕榈酸（钠）/油酸（钠）复合高脂添加剂（货号KC006）诱导其脂肪变性或脂毒性应激。该高脂细胞添加剂（货号KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照。其中，棕榈酸（钠）可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸（钠）可以用来诱导细胞代谢异常，两者联合使用适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

4. 实验内容

首先建立BMAds-软骨细胞共培养体系（图1c），实验结果显示EsrraA KO来源的BMAds分泌的CFD显著低于野生型（图1d），其CM处理软骨细胞后，分解酶（Mmp13、Mmp3等）及衰老标记（P16、P21）mRNA表达下调，而加入重组鼠C3（mC3）会加剧损伤，但EsrraA KO组仍可减轻损伤（图1e）。蛋白水平上，图1f结果显示，野生型BMAds CM可诱导pERK1/2、P21和MMP13表达升高，同时COL2A1表达降低，加入mC3后损伤进一步加重，而EsrraA KO CM可以逆转这一效应。免疫荧光数据显示，MAC和pERK1/2共定位在软骨细胞膜及胞质异常分布，联合mC3后沉积增多，而EsrraA KO组显著减少。线粒体层面，MitoTracker Red染色显示线粒体网络发生碎片化，MitoSOX Red染色显示ROS水平升高，这两种改变在野生型+mC3组中最为显著，而EsrraA KO组的线粒体管状结构得以恢复，ROS水平也有所降低。野生型+mC3组中γH2AX、P21核阳性细胞数增加，Ki67阳性细胞减少，同时SA-β-Gal阳性率升高，EsrraA KO组可明显逆转上述改变。Seahorse呼吸实验证实，野生型BMAds CM可降低基础与最大耗氧率，加入mC3后抑制效应进一步增强；而EsrraA KO CM可恢复细胞氧化能力、改善线粒体功能。

图1.  ESRRA敲除BMAds所致的CFD下调阻断C3-CFD-MAC级联介导的软骨细胞线粒体功能障碍、衰老和分解代谢

进一步，为了模拟代谢应激下的肝源性C3，研究者用胆固醇或油酸/棕榈酸混合物处理原代肝细胞（图2f），发现C3表达和分泌显著增加。随后建立三层共培养：上层为胆固醇处理肝细胞，下层为软骨细胞，并添加BMAds CM（图2g）。如图2h所示，经胆固醇处理的肝细胞会使软骨细胞的pERK、P21、MMP13水平升高，COL2A1水平下降；加入野生型BMAds CM后上述变化进一步加剧，EsrraA KO CM则可以显著改善这一现象。免疫荧光（图2i-j）结果显示，野生型CM组的MAC沉积和pERK1/2活化增强，线粒体损伤与衰老标记也同步恶化，而EsrraA KO组可有效阻断上述变化。

图2. 抑制脂肪细胞ESRRA/CFD信号通路可使软骨细胞在代谢应激条件下免受过量肝细胞来源C3的损伤

人源验证实验中，图3b展示用AP处理人BMAds可抑制ESRRA和CFD的表达（图3c），收集CM处理C28/I2细胞并加入人重组C3和Danicopan。图3d显示，AP-CM或Danicopan均可降低pERK、P21、MMP13的表达，升高COL2A1的水平，且二者联合应用效果更佳。免疫荧光（图3e-f）确认MAC-pERK共定位减少，线粒体形态恢复，ROS和衰老指标下调。体内药效学的实验数据显示老年小鼠口服AP后，骨髓CFD和血清C3水平降低，MAT减少，关节软骨MAC沉积和pERK信号被抑制，同时MMP13、γH2AX和TUNEL阳性细胞减少，COL2A1和Ki67表达上调。

图3. Danicopan或AP通过抑制CFD可保护人C28/I2软骨细胞免受衰老和分解代谢的侵害

5. 总结

骨关节炎是一种与衰老相关的全身性疾病，涉及多个器官/组织的代谢和炎症反应，但对肝脏和骨髓脂肪组织（MAT）的作用知之甚少。本文研究发现，脂肪变性肝脏来源的补体因子D（CFD）与骨髓脂肪组织（MAT）来源的补体成分3（C3）可协同驱动过度的替代补体激活，导致小鼠在衰老和代谢障碍过程中发生软骨损伤。从机制上讲，雌激素相关受体α(ESRRA）在转录水平上上调CFD对骨髓脂肪细胞（BMAd）增殖的反应。抑制BMADS中的ESRRA/CFD信号通路可阻断脂肪变性肝细胞释放的C3引起的软骨细胞衰老和分解代谢，阻断C3-CFD-MAC级联反应，从而抑制ERK1/2的磷酸化和线粒体功能障碍。脂肪细胞特异性敲除或药物抑制ESRRA可降低CFD水平，特别是在富含脂肪细胞的骨髓中，从而减缓老年小鼠骨关节炎的病理进展。本研究揭示了一条由C3-CFD-MAC通路介导的关键“肝脏-骨髓脂肪组织-软骨”轴，为靶向脂肪细胞ESRRA治疗衰老相关代谢性骨关节炎提供了可能性。

小编有话说：

研究者使用250 μmol/L油酸和125 μmol/L棕榈酸混合处理原代肝细胞24小时，模拟脂质过载状态，成功诱导C3高表达和分泌，证实肝细胞是代谢应激下C3的重要来源。材料方法中详细记录了原代软骨细胞分离（0.4% Ⅱ型胶原酶消化）、BMSCs成脂分化（含地塞米松、IBMX、胰岛素，伴或不伴罗格列酮）、Transwell共培养（孔径0.4 μm），以及Seahorse（每孔3万细胞）等标准流程。高脂添加剂棕榈酸购自鲲创生物科技（Kunchuang Biotechnology）（货号KC003），其纯度和稳定性保障了脂毒性模型的可靠性。基于本研究的强有力证据，靶向ESRRA-CFD补体轴的策略有望拓展至临床，而优质的高脂细胞添加剂（KC003/KC006）将为代谢性骨关节病的机制探索提供坚实工具，助力更多跨器官通讯研究。

参考文献

Huang, T.; Wang, Z.; Gao, L.; Gao, J.; Lu, Z.; Li, P.; Choy, C.-A. Targeting Adipocyte ESRRA Alleviates Osteoarthritis via Interrupting Inter-Organelle Crosstalk of Complement C3-CFD-MAC Cascade. Bone Research 2026, 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41413-026-00527-3.