高脂细胞添加剂棕榈酸钠诱导小鼠C2C12成肌细胞衰老模型（细胞活力、脂质积累）
1）本文采用棕榈酸钠诱导的小鼠C2C12成肌细胞衰老模型，明确了最优浓度2.5μM下 ASP干预5天可以减缓衰老相关-β-半乳糖苷酶活性的增强、脂质的积累和P21、P16表达的增多，同时上调Klotho的表达。上述低浓度、长时间的细胞衰老诱导方案与常见的300-500μM、48-72小时损伤、炎症诱导方案不同，具有一定参考价值。 2）后期检测细胞活力（CCK-8或MTT）时，在高脂试剂和溶剂对照处理后，加入CCK-8或MTT前，需用PBS清洗2-3次，以去除溶剂对照和高脂试剂对吸光度的影响。
高脂细胞添加剂棕榈酸钠诱导小鼠C2C12成肌细胞衰老模型（细胞活力、脂质积累）
陈祁/浙江大学/博士论文
1. 前言
肌肉衰老，尤其是其功能的衰老性减退深刻影响着中老年人的健康、独立性和生活质量。作为多功能信号传导和能量代谢中心，线粒体将细胞功能、代谢和年龄相关疾病联系起来，肌肉中线粒体功能障碍与衰老的发生、发展密切相关。
特异性自噬-线粒体自噬是一种靶向清除功能失调或受损线粒体的质量控制方式，其活性对于衰老过程中肌肉健康和线粒体稳态尤为关键，因此线粒体自噬增强剂在预防和治疗肌肉衰老方面具有较好的应用前景。许多植物具有潜在的线粒体自噬调节和抗肌肉衰老功能，其中食用花卉是一大类具有抗衰老价值的新兴食物资源。本研究以多种国内常见食用花卉为研究对象，结合细胞模型揭示上述活性成分的作用机制，具体利用棕榈酸钠诱导的小鼠C2C12成肌细胞衰老模型，结合CCK-8、细胞染色和蛋白质印迹实验，确定车叶草苷抗细胞衰老作用。
2. 方法与材料
本文以小鼠成肌（C2C12）细胞为对象，采用棕榈酸钠（KC001，Kunchuang Biotechnology）作为游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs），完成体外细胞实验。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、常温无析出、浓度精准，而且无需多次加热助溶，显著减少了操作步骤，提升了实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。
3. C2C12成肌细胞衰老模型建立与给药处理
参考Moustogiannis等的研究，采用C2C12成肌细胞多倍增殖模型复制细胞衰老，并结合高脂细胞添加剂棕榈酸钠（PAS）干预诱导细胞衰老。具体来说，按照细胞培养方法将传代数>20的C2C12成肌细胞以合适的细胞密度接种于6或者96孔板中。37°C，5% CO2的细胞培养箱中培养2天后，孔中细胞密度约70%~80%。更换不同的含药完全DMEM培养基继续培养，该分化完全培养基中马血清浓度为2%，双抗浓度为1%。每天换液，5天后移走原先完全培养基，PBS充分清洗后收集细胞。
图1 细胞实验设计图
4. 细胞活力测定
采用CCK-8法测定不同药物干预组细胞的活力。C2C12成肌细胞接种于96孔板中。更换分化完全培养基中棕榈酸钠的浓度分别0，7.25，12.5，25，50μM，每日换液，继续培养5天后弃去培养基，用PBS清洗2~3次，然后每孔加入现配现用的CCK-8工作液100μL（含新鲜完全培养基90μL和10μL CCK-8试剂）。继续培养2h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。
通过细胞活力变化，确定棕榈酸钠造模浓度。在此基础上，不同给药分化完全培养基中在含有特定浓度棕榈酸钠基础上，棕榈酸钠浓度分别为0，0.1，0.5，2.5，12.5，25μM，按照上述步骤同样测定细胞活力。
随后，进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色、油红O染色、Seahorse实验、线粒体膜电位分析、ROS生成水平检测等。其中，ROS生成水平检测中，需要针对37°C 细胞培养箱孵育20 min 后用无血清DMEM 培养基清洗 3 次。
4．结果分析
采用CCK-8法测定了不同浓度棕榈酸钠对C2C12成肌细胞活力的影响。如图2所示，50μM棕榈酸钠干预细胞5天使得其细胞活力出现显著下降（P<0.001），而25μM浓度干预尽管细胞活力有所下降，但效果并不显著（P>0.05）。本研究因此选择了25μM 棕榈酸钠诱导成肌细胞的衰老，同时该浓度不会使得衰老细胞增殖率发生明显变化，即发生严重的凋亡。
图2 棕榈酸钠对C2C12细胞活力的影响
随后基于该细胞模型，在25μM棕榈酸钠诱导成肌细胞衰老下，本研究探究了0~25μM系列浓度的车叶草苷干预对衰老细胞活力的影响，以及车叶草苷对衰老成肌细胞β-半乳糖苷酶活性的影响，车叶草苷对衰老成肌细胞衰老相关蛋白表达的影响等。
其中，在衰老细胞模型上，本研究利用油红O染色分析车叶草苷干预是否仍具有上述作用。如图3所示，棕榈酸钠干预使得成肌细胞中脂质积累加剧，而车叶草苷和尿石素A干预有效减缓了这种加剧（P<0.01）。并且车叶草苷上述作用具有剂量效应，随着其干预浓度的升高，减缓脂质积累的效果更加地明显。
图3 药物组对衰老成肌细胞脂肪积累的影响
图中， C表示对照组，M表示模型组，ASP-L表示低剂量（0.5μM）车叶草苷处理组，ASP-M表示中剂量（2.5μM）车叶草苷处理组，ASP-H表示中剂量（12.5μM）车叶草苷处理组，UA表示尿石素A处理组。
此外，在细胞ROS生成水平检测中，模型组衰老细胞ROS含量较正常对照组显著升高3倍多（P<0.001）。而2.5μM的药物组干预显著减缓了衰老细胞中ROS的积累（P<0.001），这与腓肠肌和线虫中研究结果相一致。
图4 药物组对衰老成肌细胞ROS 生成的影响
小编有话说：
1）本文采用棕榈酸钠诱导的小鼠C2C12成肌细胞衰老模型，明确了最优浓度2.5μM下 ASP干预5天可以减缓衰老相关-β-半乳糖苷酶活性的增强、脂质的积累和P21、P16表达的增多，同时上调Klotho的表达。上述低浓度、长时间的细胞衰老诱导方案与常见的300-500μM、48-72小时损伤、炎症诱导方案不同，具有一定参考价值。
2）后期检测细胞活力（CCK-8或MTT）时，在高脂试剂和溶剂对照处理后，加入CCK-8或MTT前，需用PBS清洗2-3次，以去除溶剂对照和高脂试剂对吸光度的影响。
参考文献
陈祁. 杜仲雄花车叶草苷预防衰老性肌肉功能减退的作用及其机制研究[D], 浙江大学，博士论文，2023(9).
