JCI Insight（IF/ 6.1）：棕榈酸钠模拟糖尿病肾病中的代谢应激环境处理人足细胞（HPCs）以建立高脂损伤细胞模型

1. 研究背景

糖尿病肾病（DN）作为糖尿病最主要的微血管并发症，是全球范围内导致慢性肾脏病和终末期肾病的主要原因，构成了巨大的健康负担。当前DN的临床诊断严重依赖于尿白蛋白排泄率（UACR）和估算肾小球滤过率（eGFR）等指标，但这些指标在疾病早期敏感性不足，且无法精准反映肾小球固有细胞（如足细胞）的具体损伤机制。肾活检虽是病理诊断的金标准，但其侵入性限制了在早期筛查和动态监测中的应用。因此，寻找非侵入性、高特异性的生物标志物并阐明其背后的病理机制成为领域内亟待突破的关键。尿液细胞外囊泡（uEVs）因其直接来源于泌尿系统细胞、携带丰富的分子信息且易于无创获取，近年来被视为极具潜力的生物标志物新来源。肌球蛋白IC（MYO1C）是参与细胞骨架动力学和膜运输的关键分子，在维持足细胞正常结构中扮演重要角色，但其在DN发生发展中的作用，尤其是作为uEVs来源的标志物及其介导损伤的具体通路，尚不明确。

2. 技术路线

研究者首先在训练队列（40例T2DNvs33例2型糖尿病）中验证了6个候选uEVs RNAs的表达差异，进而采用六种机器学习算法构建诊断模型，经交叉验证和独立测试队列证实集成投票模型性能最佳（AUC分别为0.877和0.824），SHAP分析明确MYO1C mRNA是贡献最大的特征。随后，结合体外高糖高脂刺激的人足细胞和体内高脂喂养的db/db小鼠模型，通过敲低/过表达MYO1C联合p38通路干预，阐明其在足细胞损伤中的功能及分子机制。

细胞实验方面，研究者使用条件永生化人足细胞（HPCs），以30 mM高糖联合150 μM棕榈酸钠（PA）处理48小时构建高糖高脂（HGHF）损伤模型。CCK-8实验证实该浓度组合在保证细胞适度存活率的前提下诱导损伤。通过检测足细胞标志蛋白（NPHS2、SYNPO、WT-1）、炎症因子TNF-α及凋亡蛋白cleaved caspase-3，结合siRNA敲低MYO1C和p38激动剂/抑制剂干预，证实MYO1C通过激活p38/p-CREB通路驱动足细胞损伤。

3. 棕榈酸高脂细胞添加剂

本文在体外细胞模型中，棕榈酸钠联合葡萄糖模拟糖尿病肾病中的代谢应激环境处理人足细胞（HPCs）以建立高糖高脂损伤细胞模型

该棕榈酸钠高脂细胞添加剂（现货号KC002、原货号KJ002）包括了独立包装的10 mmol/L棕榈酸钠以及溶剂对照，上述试剂均与其他现有品牌高脂细胞添加剂相比，具有如下显著优点：

1）该棕榈酸钠高脂细胞添加剂为无菌液体溶液，浓度准确，可以直接按比例溶解在细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。

2）该棕榈酸钠高脂细胞添加剂的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。

3）该棕榈酸钠高脂细胞添加剂低温无析出、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

针对不同细胞种类及实验目的，本产品所用浓度不同，一般与培养基总体积按比例稀释，建议的终浓度范围为50-500 μmol/L。对于首次使用本产品，建议采用浓度梯度处理细胞，摸索针对特定细胞、达到特定效果的适宜浓度。处理时间上可通过镜下观察细胞状态初步判断，一般24—48小时为宜。

需要说明的是，该棕榈酸钠高脂细胞添加剂（货号KC002）可以按比例直接添加至完全培养基（含10% FBS，1% P/S）中，无需再额外添加牛血清白蛋白（BSA）。此外，还推荐直接使用高糖高脂试剂盒（KT001），该试剂盒包括了棕榈酸钠、高脂对照、葡萄糖以及甘露醇，使用更加方便。

4. 实验内容

首先，为了模拟2型糖尿病肾病（T2DN）中高血糖合并脂毒性的微环境，研究者通过CCK-8法筛选了合适的高糖和棕榈酸钠浓度。如图1A所示，与正常葡萄糖对照组相比，30 mM高糖联合150 μM、300 μM或600 μM PA处理48小时后，足细胞活力均显著下降（P<0.01），其中150 μM PA组细胞活力下降约30%—40%，而更高浓度（300或600 μM）导致过度毒性，因此后续实验统一采用30 mM高糖联合150 μM PA处理48小时，定义为高糖高脂（HGHF）条件。在此条件下，研究者进一步表征了足细胞来源的细胞外囊泡（hEVs）。如图1B的透射电镜图像所示，hEVs呈现典型的杯状形态，粒径集中在60-90 nm，纳米流式分析进一步确认了该粒径分布，并且这些囊泡阳性表达CD9、Alix和TSG101等经典外泌体标志物，而内质网蛋白Calnexin表达极低，排除了细胞碎片污染，保证了后续RNA分析的可靠性。

在验证MYO1C的表达变化时，研究者采用qPCR和免疫印迹两种方法。如图1C所示，在HGHF处理48小时后，hEVs内部以及足细胞本身的MYO1C mRNA水平均显著高于正常葡萄糖对照组，且处理24小时已出现上升趋势，48小时差异更明显。免疫印迹结果（图1D）进一步证实，HGHF组的MYO1C蛋白表达升高，与此同时足细胞的关键标志蛋白——NPHS2、SYNPO和WT-1均显著下调，而炎症因子TNF-α和凋亡执行蛋白cleaved caspase-3则明显增加。图1E的qPCR数据在转录水平上复现了这一趋势：MYO1C mRNA升高超过2倍，SYNPO和NPHS2 mRNA下降，TNF-α mRNA上升。此外，免疫荧光染色（图1F）直观地显示，在正常葡萄糖组中SYNPO（红色）呈均匀的细胞质分布，而HGHF刺激后红色荧光明显减弱且细胞形态变得不规则；相反，MYO1C（绿色）在正常组中表达较弱，HGHF组中则显著增强。值得注意的是，单独使用高脂（PA）而不加高糖的HM组并未引起SYNPO或MYO1C的显著变化，说明高糖与高脂具有协同损伤效应。

为了检验MYO1C是损伤的被动伴随还是主动驱动因素，研究者设计了siRNA敲低实验。免疫印迹及定量分析所示，在正常葡萄糖条件下转染MYO1C siRNA的足细胞，其MYO1C蛋白水平较转染阴性对照siControl组显著降低，且对SYNPO、NPHS2、WT-1等足细胞标志物无影响，说明敲低本身不干扰基础状态下的足细胞分化。而在HGHF刺激下，siControl组的足细胞表现出典型的损伤表型：MYO1C升高、足细胞标志物下降、TNF-α和cleaved caspase-3上升。然而，在HGHF+siRNA组中，MYO1C表达被成功敲低后，上述损伤指标被显著逆转——SYNPO、NPHS2和WT-1恢复至接近正常水平，同时TNF-α和cleaved caspase-3的表达也明显降低。

图1. 综合分析高糖和高脂肪对足细胞活性、EVSRNA表达和HPC分子表达模式的影响

图2C的免疫荧光染色进一步证实了这一保护效应：在HGHF+siControl组中，MYO1C（绿色）荧光强烈且F-actin（红色）标记的细胞骨架变得松散紊乱；而在HGHF+siRNA组中，MYO1C荧光显著减弱，F-actin骨架则保持了较好的连续性和规则的细胞形态。这些数据强有力地证明，MYO1C是足细胞在高糖高脂环境下损伤的关键驱动因子。

图2. 基因敲除对HGHF致足细胞损伤的保护作用

图3. MYO1C通过p38/p-CREB途径介导HGHF诱导的足细胞损伤

分子机制层面，研究者聚焦于p38 MAPK信号通路。如图3C和3D所示，在正常葡萄糖条件下使用腺病毒过表达MYO1C（NG+Ad-MYO1C组），即可模拟损伤表型：足细胞标志NPHS2、SYNPO、WT-1表达下降，cleaved caspase-3、p-p38/p38比值及下游p-CREB水平升高，而加入p38特异性抑制剂SB203580后，p-CREB和TNF-α的表达被部分逆转，足细胞标志蛋白得以恢复，但MYO1C本身的表达水平不受抑制剂影响，表明MYO1C作用于p38的上游。相反，在HGHF条件下敲低MYO1C的细胞中，若同时给予p38激动剂Dehydrocorydaline，则会抵消siRNA的保护效应。如图3E所示，HGHF+siRNA组本已降低的p-p38/p38和cleaved caspase-3水平在加入Dehydrocorydaline后重新升高，SYNPO表达再次下降。这一双向干预实验清晰地证明，p38/p-CREB信号轴是MYO1C介导足细胞损伤所必需的完整通路。

5. 总结

T2DN是2型糖尿病的主要并发症，也是慢性肾脏疾病的主要原因。本研究旨在探讨肌球蛋白IC(MyosinIC，MYO1C）作为T2糖尿病肾病足细胞损伤的候选生物标志物，并阐明其在T2糖尿病肾病足细胞损伤机制中的作用。使用从33例2型糖尿病和40例T2糖尿病患者的训练和验证队列中识别的尿胞外小泡RNA生物标志物，我们开发了一种T2糖尿病的机器学习诊断模型。该模型在验证中获得了0.877的AUC值，并在独立测试队列中表现良好，AUC值为0.824。MYO1C被认为是最终模型中最有影响力的特征。体外和体内的机制研究表明，高糖和高脂条件导致足细胞损伤、炎症和细胞凋亡，并增加MYO1C的表达。在体外和体内，MYO1C基因敲除可以减少足细胞损伤和炎症反应。MYO1C过表达增强了p38、p-CREB和肿瘤坏死因子－α的水平，而抑制p38则减轻了这些影响。这些发现支持MYO1C不仅是T2糖尿病潜在的尿液生物标志物，而且是通过p38 MAPK信号促进足细胞损伤的关键致病驱动因素。

小编有话说：

本研究采用30 mM高糖联合150 μM棕榈酸钠处理48小时构建高糖高脂（HGHF）损伤模型，成功模拟了高糖联合脂毒性环境，诱导出足细胞标志蛋白下调、炎症及凋亡激活的典型损伤表型。在原文的材料与方法中明确，棕榈酸钠储液（10 mM）购自西安鲲创生物科技（货号SYSJ-KJ002），溶于高糖培养基后即形成高糖高脂条件。该细胞处理方案为体外筛选靶向脂代谢相关足细胞损伤的药物提供了稳定、可重复的评价模型。展望未来，西安鲲创生物科技作为高品质棕榈酸钠等脂质添加剂的供应商，将持续助力糖尿病肾病及代谢相关肾损伤研究的精准体外建模，为机制探索和药物筛选提供可靠工具。

参考文献

Zhao, Z. Yan, Q. Zhou, S. Liu, F. Liu, Y. Ren, J. Pan, S. Liu, Z. Liu, D. Liu, Z. MYO1C Is a Urinary Extracellular Vesicle Biomarker and Mediator of Podocyte Injury in Diabetic Nephropathy. JCI Insight 2026, 11 (5). https://doi.org/10.1172/jci.insight.194604.