BIOB.（IF/ 5.1）：体外游离脂肪酸（FFA）模拟脂代谢紊乱环境诱导AML12肝细胞脂质沉积

1. 研究背景

代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）是全球最常见的慢性肝病之一，其发病机制复杂，涉及脂毒性、胰岛素抵抗、慢性炎症及肠道菌群失调等多重因素。目前尚无特效治疗药物，亟需探索新的干预策略。熊果苷（ARB）作为一种天然氢醌糖苷，已知具有抗炎、抗氧化及调节肠道菌群的活性，但其对MAFLD的治疗效果及分子机制尚未明确。近年来，多组学技术（转录组、16S rRNA测序、非靶向代谢组）联合网络药理学和分子对接，已成为揭示天然产物作用靶点与通路的有力工具。本研究以此为基础，首先通过生物信息学挖掘MAFLD相关转录组数据，预测ARB的潜在靶点，并借助KEGG与GO富集分析锁定细胞凋亡和STAT3信号通路。随后，在体内高脂饮食诱导的MAFLD小鼠模型和体外游离脂肪酸（FFA）诱导的AML12肝细胞模型中，结合病理染色、生化检测、分子生物学技术及肠道微生态分析，系统阐明ARB的双重作用机制——既通过靶向STAT3抑制肝细胞凋亡，又通过重塑肠道菌群及其代谢物改善肝脏微环境。这一多维度研究策略为天然产物治疗MAFLD提供了新视角。

2. 技术路线

本研究首先通过高脂饮食喂养C57BL/6J小鼠建立体内MAFLD模型，并给予不同剂量ARB干预；同时采用油酸和棕榈酸处理AML12肝细胞建立体外模型。通过生物信息学预测ARB靶点与MAFLD相关基因的交集，结合分子对接和CETSA验证关键靶点STAT3。随后通过qPCR、Western blot分析凋亡通路蛋白表达，利用16S rRNA测序和超高效液相色谱-高分辨质谱（UPLC-HRMS）分析肠道菌群及粪便代谢物变化，阐明ARB通过抗凋亡和调节肠道菌群双重机制改善MAFLD。

细胞实验方面，以AML12小鼠肝细胞为对象，使用油酸与棕榈酸（摩尔比2:1）混合制备0.5mM游离脂肪酸（FFA）工作液模拟脂代谢紊乱环境。ARB处理24小时后，通过油红O染色观察脂质沉积，CCK-8法检测细胞活性。进一步采用siRNA沉默STAT3基因，验证STAT3在ARB抗凋亡中的作用。Western blot检测BAX、BCL2、caspase3及cleaved caspase 3等凋亡蛋白表达，CETSA实验评估ARB与STAT3的直接结合能力。

3. 体外游离脂肪酸（FFA）（PA/OA）

本文在体外细胞模型中，使用棕榈酸、油酸作为体外游离脂肪酸（FFA）模拟脂代谢紊乱环境诱导AML12肝细胞成功建立脂质沉积细胞模型。

使用的关键试剂如下：该高脂细胞添加剂（货号KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸（钠）、12 mmol/L油酸（钠）以及溶剂对照，上述试剂均与其他现有品牌高脂细胞添加剂相比，具有如下显著优点：该添加剂为无菌液体溶液，浓度准确，可以直接按比例加入细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。该添加剂的溶剂无毒，配制过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。该添加剂低温无析出、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

需要说明的是，该高脂细胞添加剂中的棕榈酸（钠）可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸（钠）可以用来诱导细胞代谢异常。棕榈酸（钠）和油酸（钠）可以单独使用，也可以联合使用，棕榈酸（钠）和油酸（钠）联合诱导更加符合人体环境，适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。需要说明的是，该试剂可以按不同比例直接添加至完全培养基（含10% FBS，1% P/S）中，无需再额外添加牛血清白蛋白（BSA）。

4. 实验内容

在细胞实验的详细阐述中，本研究以AML12肝细胞为体外模型，深入探讨了ARB对脂毒性诱导的肝细胞损伤的保护作用及其分子机制。如图3所示，油红O染色结果显示，与对照组相比，FFA处理组细胞中红色脂滴大量聚集，表明成功建立了脂质沉积模型；而不同浓度ARB（如12.5、25、50、100 μM）共处理24小时后，脂滴面积显著减少，呈浓度依赖性，其中100 μM ARB效果最为明显。

图3. 在AML12细胞中ARB抑制了FFA诱导的体外MAFLD模型中的脂质沉积

CCK-8检测结果进一步显示，ARB在100 μM浓度以下对细胞活性无明显毒性，且能显著提高FFA处理后的细胞存活率，表明ARB具有保护肝细胞免受脂毒性损伤的作用。为了解析其抗凋亡机制，采用Western blot检测了凋亡相关蛋白表达。与HFD小鼠肝脏结果一致，在FFA处理的AML12细胞中，促凋亡蛋白BAX和cleaved caspase 3表达升高，而抗凋亡蛋白BCL2表达降低；给予ARB干预后，BAX/BCL2比值显著下降，cleaved caspase 3水平降低，提示ARB能够抑制脂毒性诱导的凋亡通路激活。 

如图5所示，CETSA实验结果显示，通过CETSA实验验证ARB的直接靶点，随着加热温度升高（42–62℃），ARB处理组中STAT3蛋白的热稳定性显著高于对照组，表明ARB能够直接结合STAT3并增强其稳定性。在此基础上，通过siRNA敲低STAT3（si-STAT3）后，如图5所示，ARB对BAX、BCL2及cleaved caspase3的调控作用明显减弱，证实STAT3是ARB发挥抗凋亡效应的关键中介分子。这些细胞层面的结果与体内动物模型中观察到的肝组织病理改善高度一致，共同支持ARB通过STAT3介导的抗凋亡通路减轻MAFLD肝损伤的结论。

图5.  ARB目标预测和实验验证

5. 总结

肠道微生物区系调控是治疗代谢功能障碍相关性脂肪肝(MAFLD)的关键策略。熊果苷(ARB)是一种天然的对苯二酚活性物质，具有抗炎、抗氧化和调节肠道微生物区系的作用。然而，其对MAFLD的治疗作用及其机制尚不清楚。为了探讨ARB治疗代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）的疗效及作用机制，以高脂饮食(HFD)喂养的小鼠为体内MAFLD模型，同时给予ARB治疗。通过组织病理学染色评价肝损伤程度。以游离脂肪酸处理的AML12细胞作为体外模型。用油红O染色和生化方法评价ARB的作用。随后，利用生物信息学技术来预测ARB的潜在机制和靶点。应用分子生物学技术检测肝细胞凋亡相关基因的表达。16S rRNA测序分析肠道微生物区系的变化。采用超高效液相色谱-高分辨质谱仪分析大鼠粪便代谢物水平的变化。结果显示ARB治疗能有效改善MAFLD小鼠的肝损伤。其作用机制可能与信号转导和转录激活因子3介导的抗细胞凋亡作用有关。同时，ARB能有效逆转MAFLD小鼠肠道微生物区系失衡，改变肠道微生物和粪便代谢产物的组成。最后得出ARB可减轻MAFLD的病理改变，发挥抗细胞凋亡作用，恢复肠道菌群平衡。

小编有话说：

本研究采用油酸（钠）和棕榈酸（钠）（摩尔比2:1）配制0.5 mmol/L FFA工作液，模拟肝细胞脂质超负荷环境。AML12细胞经FFA诱导24小时形成脂质沉积模型，同时加入不同浓度ARB评估其保护作用。文中详细描述了细胞培养条件（DMEM/F12培养基含10% FBS、胰岛素、转铁蛋白、硒、地塞米松及双抗）、FFA配制方法、油红O染色及CCK-8检测步骤。油酸（钠）和棕榈酸（钠）混合液有效模拟了MAFLD的脂毒性微环境，ARB通过直接结合STAT3抑制凋亡通路，展现出治疗潜力。鲲创生物科技作为高脂细胞添加剂的专业供应商，我们推荐使用高纯度油酸（钠）（纯度≥99%）和棕榈酸（钠）（纯度≥98%），产品经过严格质检，批次间稳定性高，能高效构建脂毒性细胞模型。展望未来，此类添加剂不仅适用于MAFLD研究，还可拓展至糖尿病、动脉粥样硬化等代谢疾病领域，为药物筛选和机制探索提供可靠工具。

参考文献

Yin, D.; Cheng, J.; Cao, H.; Wang, X.; He, J.; Zhu, Y.; Li, J. Mechanism of Arbutin in Metabolic Dysfunction-Associated Fatty Liver Disease Based on Multi-Omics Research. Bioresources and Bioprocessing 2026, 13 (1). https://doi.org/10.1186/s40643-026-01032-5.