J. Ethnopharmacol.（IF/ 5.4）：棕榈酸油酸联合血管紧张素Ⅱ处理HepG2人肝癌细胞系构建体外脂肪变性模型

1. 研究背景

桃红四物汤（THSWD）是一种源自《医宗金鉴》的经典复方，传统上用于活血化瘀。近年来，射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）与代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）常并存，二者在理论上同属“气滞血瘀”范畴，现代医学则认为其共享胰岛素抵抗、慢性炎症和脂代谢紊乱等病理基础。然而，目前尚无专门针对HFpEF合并MAFLD的有效药物。基于此，该研究采用高脂饮食（HFD）+ L-NAME“双打击”策略构建经典HFpEF小鼠模型，结合UPLC-Q-TOF/MS化学成分鉴定、网络药理学预测、肝脏RNA-seq转录组分析以及体内外功能验证，系统探讨THSWD改善HFpEF相关肝脂质蓄积的作用机制。研究发现，THSWD可通过激活AMPK信号通路，抑制其下游SREBP1介导的脂合成基因表达，从而减轻肝脏脂肪变性。

2. 技术路线

研究采用“体内模型与体外验证相结合”的技术路线展开。在体实验，采用HFD + L-NAME饮水建立雌性小鼠的“双打击”模型，通过超声心动图评估心功能，并通过肝脏油红O染色、H&E染色及甘油三酯（TG）含量测定评估脂质积累。同时，运用UPLC-Q-TOF/MS鉴定THSWD化学成分，并整合网络药理学和肝脏组织的RNA-seq数据预测其作用靶点与通路。体外实验部分则采用HepG2细胞建立脂肪变性模型，验证THSWD的直接效应并深入探究其作用机制。

在细胞实验层面，研究者使用HepG2人肝癌细胞系，以油酸（500 μM）和棕榈酸（250 μM）联合血管紧张素Ⅱ（100 nM）处理36小时，构建体外脂肪变性模型。随后给予不同浓度THSWD（5或10μg/μL）干预，同时设置AMPK选择性抑制剂dorsomorphin、AMPKα1/α2 siRNA及SREBP1 siRNA的挽救实验，通过油红O染色、甘油三酯含量测定、qPCR和Western blot等技术手段验证药物作用机制。

3. 棕榈酸油酸高脂细胞添加剂（PA/OA）

本文在体外细胞模型中，使用棕榈酸、油酸联合血管紧张素Ⅱ处理HepG2人肝癌细胞系，以构建稳定的体外脂肪变性模型。

使用的关键试剂如下：该高脂细胞添加剂（货号KC003、KC005）包括了独立包装的棕榈酸、油酸以及溶剂对照，上述试剂均与其他现有品牌高脂细胞添加剂相比，具有如下显著优点：该添加剂为无菌液体溶液，浓度准确，可以直接按比例加入细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。该添加剂的溶剂无毒，配制过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。该添加剂低温无析出、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

需要说明的是，该高脂细胞添加剂中的棕榈酸可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸可以用来诱导细胞代谢异常。棕榈酸和油酸可以单独使用，也可以联合使用，棕榈酸和油酸联合诱导更加符合人体环境，适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。需要说明的是，该试剂可以按比例直接添加至完全培养基（含10% FBS，1% P/S）中，无需再额外添加牛血清白蛋白（BSA）。

此外， 也可以使用棕榈酸钠、油酸钠复合高脂添加剂（货号KC006），包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用，按照比例添加至完全培养基中，例如：油酸（钠）：母液浓度12 mmol/L→作用浓度0.5 mmol/L，稀释了24倍；棕榈酸（钠）：母液浓度6 mmol/L→作用浓度0.25 mmol/L，稀释了24倍； 24份总体积=1份油酸（钠）+1份棕榈酸（钠）+22份完全培养基。

4. 实验内容

在细胞实验中，研究者首先构建了稳定的脂肪变性HepG2细胞模型。如图1A所示，油红O染色清晰地展示了正常对照组细胞中几乎无红色脂滴，而模型组细胞则充满了大量红色脂滴，表明高脂与血管紧张素Ⅱ联合处理成功诱导了显著的脂质蓄积。给予THSWD处理后，细胞内红色脂滴数量明显减少，且高浓度组效果更佳。图1B和6C的定量分析进一步证实，THSWD可将细胞内脂质沉积面积和甘油三酯含量分别降低约40%和50%，与模型组相比具有统计学差异。在分子机制层面，图1D展示了Western blot的典型条带，量化分析表明THSWD处理后，p-AMPK/AMPK比值和p-ACC/ACC比值均显著升高，而SREBP1的成熟形式与前体形式之比（mSREBP1/pSREBP1）则明显下降，同时下游脂合成关键酶ACC、FASN和SCD1的蛋白表达也受到抑制。图1E的qPCR结果进一步确认，THSWD可显著降低Acaca、Fasn和Scd1的mRNA水平。

图1.  THSWD抑制脂肪变性的HepG2细胞中的脂质沉积

为了验证AMPK的关键介导作用，研究者使用dorsomorphin预处理细胞。如图2A-C所示，单用THSWD能显著减少脂滴和甘油三酯含量，但加入dorsomorphin后，THSWD的降脂效果被明显削弱。图中的蛋白分析显示，dorsomorphin阻断了THSWD诱导的AMPK和ACC磷酸化，并逆转了THSWD对SREBP1活化及下游蛋白的抑制作用。更为直接的证据来自AMPKα1/α2 siRNA敲低实验。

图2. 抑制AMPK可阻断THSWD对HepG2细胞脂质沉积的减少作用

图3. 敲低AMPK可阻断THSWD对HepG2细胞脂质沉积的减少作用

如图3A-B所示，敲低AMPK后，THSWD几乎完全丧失了减少脂滴的能力。图3中显示，AMPK敲低不仅消除了THSWD对AMPK磷酸化的增强作用，还使SREBP1及其靶蛋白的表达恢复到接近模型组的水平。

最后，为确认SREBP1是否处于AMPK下游的关键效应位置，研究者进行了SREBP1 siRNA敲低实验。图4A-B的结果显示，THSWD单独处理可有效降低脂质沉积，而联合SREBP1 siRNA并未产生叠加效应，两组之间的脂滴数量无显著差异。图4中的蛋白分析表明，THSWD处理无论是否联合SREBP1敲低，AMPK的磷酸化水平均显著高于模型组且两者相近，但SREBP1及其下游ACC、FASN的表达在联合组中并未比THSWD单用组进一步下降。这证实SREBP1是THSWD作用通路中AMPK下游的必要效应分子。

图4. THSWD通过调控SREBP1减少HepG2细胞的脂质沉积

5. 总结

细胞实验内容聚焦于评估桃红四物汤（THSWD）对肝细胞脂肪变性的干预效果及其作用机制。研究采用人肝癌细胞系HepG2建立体外MAFLD模型。首先，通过使用500 μM油酸（OA）、250 μM棕榈酸（PA）与100 nM血管紧张素Ⅱ（AngII）的混合物处理细胞，成功诱导了脂肪变性，构建了MAFLD细胞模型。在此模型基础上，研究人员评估了THSWD的疗效，发现与脂肪变性诱导剂共处理36小时后，THSWD能显著减少细胞内的脂质沉积。为深入探究其作用机制，研究进行了系列挽救实验：其一，使用AMPK选择性抑制剂Dorsomorphin进行预处理，结果显示该抑制剂阻断了THSWD的降脂效果；其二，通过siRNA敲低AMPKα1/α2的表达，同样抵消了THSWD的作用；其三，敲低其下游转录因子SREBP1（由Srebf1基因编码）后，THSWD未能产生额外的降脂效果。这些结果一致证明，THSWD减轻肝细胞脂质沉积的效应是通过激活AMPK信号通路，进而抑制其关键下游效应器SREBP1的活性来实现的，从而抑制了脂肪酸合成相关基因的表达。

小编有话说：

本研究所采用的高脂细胞添加剂（油酸、棕榈酸）来自鲲创生物科技（Kunchuang Biotechnology），其高纯度和稳定性为成功构建可靠的体外脂肪肝模型提供了关键保障，确保了实验结果的准确性与可重复性。高质量的试剂为深入揭示THSWD的药理机制奠定了坚实基础，也提示在未来的研究与开发中，选用优质的原料和标准化的试剂对于推动传统中药复方的现代化与国际化至关重要，有望为HFpEF合并MAFLD这一临床难题带来新的治疗策略。

参考文献

Qi, W.; Liu, C.; Li, D.; Yang, H.; Li, Y.; Zhang, M.; Zhang, D.; Yeung, M. H. Y.; Chen, J.; Li, J. Taohong Siwu Decoction Ameliorates Hepatic Lipid Accumulation in Female Mice with Heart Failure and Preserved Ejection Fraction via AMPK/SREBP1 Pathway. Journal of Ethnopharmacology 2026, 366, 121642. https://doi.org/10.1016/j.jep.2026.121642.