CELL MOL BIOL LETT（IF/ 10.2）：棕榈酸（PA）模拟高脂环境处理TM3小鼠Leydig细胞诱导脂滴积累、线粒体-内质网接触破坏、活性氧升高、内质网应激等

1. 研究背景

随着全球饮食结构西化，高脂饮食（HFD）的普及已成为慢性疾病与代谢综合征的重要诱因。睾丸作为高度代谢活跃的器官，对饮食压力尤为敏感，HFD可导致精子质量下降与激素水平异常，但其早期亚细胞机制尚不明确。现有研究多聚焦于单一细胞器功能障碍，而细胞器间的物理与功能交互在高脂环境下的变化及其对睾酮合成的影响仍未充分阐明。线粒体与内质网接触（MERCs）是调控钙离子转运、脂质代谢与能量平衡的关键界面，而细胞骨架在细胞器动态分布中亦扮演重要角色。本文旨在揭示HFD如何通过脂滴介导的细胞器互作失调，进而损害睾丸间质细胞(Leydig cells，LCs)细胞的睾酮合成功能。

2. 技术路线

研究首先通过单细胞转录组数据分析，发现HFD小鼠睾丸中MERCs相关基因表达显著下调，且LCs数量减少。进一步利用蛋白质组学技术，揭示脂滴与肌动蛋白细胞骨架间的相互作用。为验证脂滴在MERCs破坏中的作用，研究结合流式细胞分选与透射电子显微镜，直接观察线粒体与内质网间的距离变化，并采用ACC抑制剂Firsocostat干预脂滴合成，评估其对细胞器接触及睾酮合成功能的恢复效果。

细胞实验以TM3小鼠LCs为模型，通过棕榈酸（PA）处理模拟高脂环境，观察脂滴积累、细胞器接触及睾酮合成相关蛋白表达的变化。实验采用免疫荧光染色、蛋白质印迹、线粒体膜电位与活性氧检测等多种手段，系统评估PA对细胞结构与功能的影响。此外，通过脂滴分离与质谱分析，筛选与脂滴相互作用的细胞骨架蛋白，深入探讨其分子机制。

3. 棕榈酸高脂细胞添加剂

本文在体外细胞模型中，采用300 μM棕榈酸处理TM3细胞24小时，成功模拟了高脂环境，诱导了脂滴积累、G-actin和F-actin减少、线粒体-内质网接触破坏、线粒体膜电位和ATP下降、活性氧升高、内质网应激以及睾酮合成酶表达下调。

该棕榈酸高脂细胞添加剂（货号KC003）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸以及溶剂对照，上述试剂均与其他现有品牌高脂细胞添加剂相比，具有如下显著优点：

1）该高脂细胞添加剂为无菌液体溶液，浓度准确，可以直接按比例溶解在细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。

2）该棕榈酸高脂细胞添加剂的溶剂无毒，溶解过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。

3）该棕榈酸高脂细胞添加剂低温无析出、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

针对不同细胞种类及实验目的，本产品所用浓度不同，一般与培养基总体积按比例稀释，建议的终浓度范围为50-500 μmol/L。对于首次使用本产品，建议采用浓度梯度处理细胞，摸索针对特定细胞、达到特定效果的适宜浓度。处理时间上可通过镜下观察细胞状态初步判断，一般24-48小时为宜。

需要说明的是，该棕榈酸高脂细胞添加剂（货号KC003）可以按比例直接添加至完全培养基（含10% FBS，1% P/S）中，无需再额外添加牛血清白蛋白（BSA）。

4. 实验内容

为在细胞层面验证上述机制，研究者在TM3 LCs模型中进行了如下实验：

首先，在建立高脂细胞模型时，研究者使用TM3细胞并给予棕榈酸处理。免疫荧光染色显示，棕榈酸处理后细胞中F-actin分布变得不均匀，如图1A所示，对照组的F-actin呈清晰的纤维状分布，而棕榈酸组则出现断裂和聚集；定量分析图1B进一步证实，F-actin的平均荧光强度显著下降，而α-tubulin和Nestin变化不显著，说明高脂环境主要破坏微丝系统而非微管或中间纤维。蛋白印迹结果图1C和3D同样显示F-actin条带明显减弱，同时图1E和3F表明G-actin也显著减少，提示棕榈酸扰乱了肌动蛋白单体与聚合体之间的动态平衡。单细胞转录组数据图1G则展示了多个与肌动蛋白动态相关的基因（如Cfl1、Gsn、Wdr1）在高脂处理的小鼠间质细胞中表达下调，从转录层面验证了上述现象。

为了探究肌动蛋白减少对细胞器互作的影响，研究者对TM3细胞进行了Tom20（线粒体）和PDI（内质网）的共定位染色。如图1H所示，对照组中Tom20和PDI的荧光信号存在大量重叠区域，而棕榈酸处理后两信号明显分离。图1I的共定位分析量化了这一趋势，皮尔逊相关系数从对照组的0.7以上降至棕榈酸组的0.3左右。同时图1J再次确认了F-actin在棕榈酸组中的荧光强度下降。这些结果表明，肌动蛋白破坏直接导致线粒体与内质网的物理接触减少。

图1. 高脂会降低睾丸间质细胞中的F-actin表达，减少线粒体-内质网接触

在脂滴与肌动蛋白关系的研究中，细胞水平的证据尤为关键。图2H展示了TM3细胞中G-actin（品红色）与BODIPY标记的脂滴（绿色）的共定位情况。对照组中G-actin均匀分布于细胞质，脂滴稀少；而棕榈酸处理后，脂滴大量增多，同时G-actin荧光强度显著降低，且残余的G-actin多围绕在脂滴周围。图2I的定量分析显示，棕榈酸组G-actin荧光强度较对照组下降约60%，证实脂滴积累可能通过隔离或降解G-actin来破坏细胞骨架。

图2. 脂滴导致G-actin减少

接下来，研究者使用ACC抑制剂Firsocostat进行干预。如图3A和5B所示，棕榈酸处理后G-actin和F-actin均显著减少，而加入Firsocostat后两者几乎恢复至对照组水平。图3C展示了COX2（线粒体）和PDI（内质网）的共定位，棕榈酸组两信号分离明显，而Firsocostat处理后共定位显著改善，图3D的定量分析证实了这一点。线粒体功能方面，图3E和5F的TMRE染色流式结果显示，棕榈酸组线粒体膜电位下降约40%，Firsocostat处理可使其回升至接近对照。内质网应激标志物Bip和CHOP的蛋白印迹如图3G和5H所示，棕榈酸组Bip和CHOP均显著升高，Firsocostat处理后则明显降低。最后，图3I和5J展示了睾酮合成关键酶StAR、CYP11A1和3β-HSD的免疫荧光染色，棕榈酸组三种酶的荧光强度均显著下降，而Firsocostat处理后均得到显著恢复。

图3 在体外通过抑制LD合成、增强线粒体和内质网功能来促进睾酮的产生。

5. 总结

近年来，生殖系统疾病的发病率一直在稳步上升。此外，随着生活水平的提高，代谢性疾病的发病率也逐渐增加。然而，生殖性疾病和代谢性疾病之间的联系和机制并不明确。利用已发表的单细胞RNA测序数据，分析线粒体-内质网(ER)接触(MERCS)基因在细胞器连接性中的表达。用基于质谱仪的蛋白质组学分析脂滴(LDs)与肌动蛋白细胞骨架之间的联系。通过基于流式细胞术的细胞分选结合透射电子显微镜，我们探索了LDs介导的线粒体-内质网接触。在高脂饮食(HFD)小鼠中，许多Merc相关基因的表达减少，同时睾丸间质细胞(LCs)减少。机制上，LDs下调G-actin的表达，导致线粒体与内质网分离。从功能角度看，脂肪生成酶乙酰-辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂Firsoost可抑制LD的合成，缩短线粒体与内质网之间的距离，改善线粒体功能，促进睾酮合成。最后，靶向LDs为改善高脂条件下的LCs功能，从而保护睾丸内分泌功能提供了一种有前景的治疗策略。结论得出HFD通过破坏脂滴介导的线粒体接触而导致生殖功能障碍。

小编有话说：

本研究采用300 μM棕榈酸处理TM3细胞24小时，成功模拟了高脂环境，诱导了脂滴积累、G-actin和F-actin减少、线粒体-内质网接触破坏、线粒体膜电位和ATP下降、活性氧升高、内质网应激以及睾酮合成酶表达下调。材料与方法中明确，TM3细胞培养于含2.5%马血清和5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，37°C、5% CO₂条件下培养。该模型为研究脂毒性对间质细胞的影响提供了可靠工具。展望未来，棕榈酸（KC003）作为高脂细胞添加剂，由Kunchuang Biotechnology提供，其稳定的诱导效果为靶向脂滴-细胞骨架轴的药物筛选和机制研究奠定了坚实基础，有望推动代谢相关生殖损伤治疗策略的开发。

参考文献

Sun, L.; Wang, A.; Zhang, Y.; Chen, J.; Huang, P.; Zeng, K.; Huang, S.; Huang, J.; Luo, J.; Wang, J. High-Fat Diet Leads to Male Reproductive Dysfunction by Disrupting Lipid-Droplet-Mediated Organelle Crosstalk. Cellular & Molecular Biology Letters 2026. https://doi.org/10.1186/s11658-026-00891-2.