Signal Transduct Target Ther.（IF/ 52.7）：棕榈酸（PA）联合脂多糖（LPS）模拟炎症和脂毒性环境处理骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）

1. 研究背景

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球高发的慢性肝病，其进展与髓系细胞驱动的慢性炎症密切相关，但具体分子通路尚不明确。近年来，糖酵解重编程和乳酸化修饰成为研究热点：乳酸不仅是糖酵解终产物，还可通过蛋白乳酸化调控基因转录。同时，G蛋白偶联受体Mas在髓系细胞中高表达，但其在MASLD中的功能未知。基于此，研究者整合单细胞测序、蛋白质组学、虚拟筛选及纳米递送技术，旨在揭示髓系Mas通过代谢-炎症轴驱动疾病进展的机制，并开发靶向干预策略。

2. 技术路线

首先，构建髓系特异性Mas1敲除小鼠，结合高脂饮食（HFD）和蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）模型评估表型；通过单细胞测序明确致病性FN1⁺CCR2⁺单核前体细胞群；利用免疫共沉淀和质谱鉴定Mas与PKM2的直接互作，并解析Spi1 K208乳酸化对衰老相关分泌表型（SASP）的转录调控。进而通过虚拟筛选获得Mas抑制剂TFDG，并设计巨噬细胞膜包被纳米粒（MM@NP-TFDG）实现靶向递送。

其次，在细胞实验层面，分离骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），以脂多糖（LPS）联合棕榈酸（PA）模拟代谢性炎症应激，系统验证Mas-PKM2-Spi1乳酸化轴的功能。实验涵盖代谢表型（糖酵解速率、乳酸产量）、衰老标志（SA-β-gal、γ-H2AX）、蛋白互作（Co-IP、GST pull-down）、基因编辑（CRISPR/Cas9敲除及点突变）及人源单核细胞验证，全面解析该轴在炎症性衰老中的驱动作用。

3. 高脂细胞添加剂——棕榈酸（PA）

在体外细胞实验中，使用100 μM棕榈酸和100 ng/mL LPS联合刺激BMDMs 12-24小时，以模拟MASLD中的脂毒性及炎症微环境。

使用的关键试剂如下：该棕榈酸高脂细胞添加剂（货号KC004）包括了独立包装的10 mmol/L棕榈酸以及溶剂对照，上述试剂均与其他现有品牌高脂细胞添加剂相比，具有如下显著优点：该添加剂为无菌液体溶液，浓度准确，可以直接按比例加入细胞培养基中，无需繁琐的溶解配制工作。该添加剂的溶剂无毒，配制过程未使用NaOH、乙醇等有毒溶剂，确保实验结果可靠。该添加剂低温无析出、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。

需要说明的是，该高脂细胞添加剂中的棕榈酸可以用来诱发多种细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等，针对不同细胞种类及实验目的，本产品所用浓度不同，一般与完全培养基总体积按1:100-1:20稀释，终浓度为100-500 umol/L。对于首次使用本产品，建议采用浓度梯度处理细胞，摸索针对特定细胞、达到特定效果的适宜浓度。处理时间上可通过镜下观察细胞状态初步判断，一般24-48小时为宜。

4. 实验内容

实验主要使用骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）进行体外机制研究。通过LPS/PA刺激模拟炎症和脂毒性环境，检测Mas1敲除对BMDM糖酵解、乳酸分泌、细胞衰老表型及SASP基因表达的影响。同时利用PKM2过表达或敲除、Spi1-K208A突变等细胞模型，验证Mas-PKM2-Spi1乳酸化轴的调控作用，具体如下：

首先，通过免疫荧光共染F4/80（巨噬细胞）和CD11b（髓系细胞标志物）证实，LysMcre-Mas1fl/fl小鼠肝内巨噬细胞浸润显著减少，且其条件培养基可减轻肝细胞脂质沉积，提示Mas缺失通过细胞自主和旁分泌双重机制发挥保护作用。

其次，聚焦代谢重编程，如图1所示，GSEA分析显示Mas敲除后髓系细胞糖酵解、衰老及SASP通路显著抑制（图1b-c）；Western blot证实HK2、PKM2、LDHA等糖酵解酶蛋白水平下调（图1d）；免疫荧光中PKM2⁺巨噬细胞减少（图1e），血清及肝内乳酸浓度降低约60-70%（图1f）。此外，SA-β-gal染色和TEM显示衰老巨噬细胞频率下降（图1h），而流式细胞术表明LPS/PA刺激下Mas缺陷BMDMs中Ly6C hi向Ly6C lo的转变受阻（图1j），ECAR降低证实糖酵解能力受损（图1l-m）。这些数据直接证明Mas缺失阻断巨噬细胞的促炎衰老转型。

再次，利用单细胞测序锁定致病亚群：UMAP显示Mas敲除后“Classical Mono”（Fn1⁺CCR2⁺）比例选择性减少，该群高表达糖酵解基因且处于单核-巨噬分化早期。CellChat分析表明该群与巨噬细胞的交互作用在敲除后显著减弱。值得注意的是，多重免疫荧光显示，Mas缺失小鼠肝内PKM2⁺/γ-H2AX⁺的FN1⁺CCR2⁺单核细胞和F4/80⁺巨噬细胞显著减少，且单核细胞常紧邻巨噬细胞分布，提示其在原位启动炎症级联。 

随后，分析分子机制，图2通过LC-MS/MS鉴定PKM2为Mas互作蛋白（图2a-b），结构预测显示二者间形成9个氢键（图2c-e）。Co-IP验证LPS/PA刺激增强内源性结合（图2d），GST pull-down明确直接互作（图2g），而截短突变体实验将结合域定位于PKM2的A1/A2区（图2h-i）。图2k的核质分离实验表明，Mas缺失显著抑制PKM2核转位，这为后续乳酸化调控提供空间基础。

进一步，验证乳酸化修饰的功能，代谢组学显示MASLD患者血清L-乳酸富集，而Mas缺陷BMDMs整体乳酸化水平下降。质谱鉴定Spi1上四个乳酸化位点，其中K208位于保守Ets DNA结合域。点突变实验证实K208A突变几乎消除乳酸化。功能上，K208A突变削弱Spi1核定位，且ChIP-qPCR显示其与SASP基因（Il6、Tnfa、Mmp9、Ccl2）启动子结合力下降，荧光素酶报告基因也证实Ccl2转录活性依赖Spi1 K208。进一步用CRISPR/Cas9内源敲入K208A突变体及AAV体内回补实验，证实该位点是Mas-PKM2轴驱动SASP转录的核心效应节点。

图1. 髓系Mas1缺乏限制了MASLD期间单核巨噬细胞的糖酵解重编程和炎性衰老

图2. 髓系Mas与PKM2相互作用，促进炎症衰老

最后，转向药物干预，其中虚拟筛选获得TFDG，其可直接结合Mas（KD=44.8 μM），并在BMDMs中减少乳酸产量、破坏Mas-PKM2复合物，降低γ-H2AX⁺衰老细胞比例。纳米制剂的细胞层面优势：MM@NP-TFDG处理HFD小鼠后，流式显示Ly6C hi髓系细胞减少最显著（图3c），Western blot证实Mas、核PKM2、核Spi1及p53/p21/p16均下调（图3d），且免疫荧光中Mas⁺PKM2⁺Spi1⁺F4/80⁺四阳性细胞和γ-H2AX⁺F4/80⁺细胞数明显减少（图3e）。这些细胞水平证据充分说明该纳米制剂通过阻断髓系Mas-PKM2-Spi1轴逆转炎症衰老微环境。

图3.  MM@NP-TFDG有效靶向和减少髓系Mas驱动的代谢-炎症衰老轴以缓解MASLD

5. 总结

代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD）由持续未消退的炎症所诱发，但将免疫代谢与疾病进展联系起来的确切机制仍不明确。该研究发现，由髓系细胞表达的G蛋白偶联受体Mas，是MASLD进程中关键的代谢检查点。在MASLD患者和饮食诱导的MASLD小鼠模型中，Mas在肝髓系细胞中的表达增加。髓系特异性Mas1缺失通过抑制糖酵解重编程和炎性衰老来减轻MASLD。单细胞核酸测序分析表明，Mas1缺失特异性地损害了FN1⁺CCR2⁺单核细胞前体的糖酵解通量，进而抑制其致病分化过程。在机制上，Mas与糖酵解酶PKM2相互作用，促进乳酸的产生，从而推动转录因子Spi1在赖氨酸208处的乳酸化。SPI1-K208乳酸化促进其核定位和衰老相关分泌表型(SASP)基因的转录激活。髓系特异性PKM2消融具有Mas1缺失的保护作用，而PKM2的过表达挽救了Mas缺失引起的代谢和转录缺陷。虚拟筛选发现茶黄素-3，3‘-二没食子酸(TFDG)是一种Mas抑制剂，可以破坏Mas-PKM2的相互作用。巨噬细胞膜包裹的纳米粒(MM@NP-TFDG)可将TFDG特异性地输送到肝巨噬细胞，抑制Mas-PKM2-Spi1乳酸化轴，并改善MASLD的体内病理进展。该发现定义了一个新的Mas-PKM2-Spi1乳酸化轴，它协调MASLD的糖酵解重编程、单核细胞前体分化和巨噬细胞驱动的炎症，为MASLD的治疗提供了有针对性的纳米治疗策略。

小编有话说：

本文采用100 μM棕榈酸（PA）联合100 ng/mL脂多糖（LPS）处理骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）24小时，成功模拟代谢性炎症应激，诱导Mas-PKM2互作增强、糖酵解上调和Spi1乳酸化。文中明确BMDMs分化使用10 ng/mL M-CSF培养7天，人THP-1细胞维持在含10% FBS的RPMI 1640中。棕榈酸高脂细胞添加剂（KC004）作为关键造模试剂，有效模拟MASLD的脂毒性微环境。展望未来，基于棕榈酸高脂细胞添加剂构建的体外筛选体系可进一步用于评估新型Mas靶向化合物，而鲲创科技（Kunchuang Tech.）提供的优质棕榈酸试剂为代谢性炎症研究提供了可靠工具，助力精准干预策略的临床转化。

参考文献

Zhao, L.; Xu, S.; Qiao, S.; Wang, Z.; Wang, S.; Liu, C.; Zhang, S.; Wang, P.; Sun, X.; Li, S. Myeloid Mas Drives Pyruvate Kinase M2-Mediated Spi1 Lactylation to Fuel Inflammatory Senescence in MASLD. Signal Transduction and Targeted Therapy 2026, 11 (1). https://doi.org/10.1038/s41392-026-02704-6.