棕榈酸油酸诱导HepG2 细胞脂质沉积、铁死亡建立NAFLD模型

—肖艳新/河北医科大学

1. 前言

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD) 主要的病理表现为肝脏脂质聚积，即超过5%的肝细胞发生脂肪变性或肝细胞内的脂肪含量超过5%。应用油红O染色肝细胞会出现红色脂滴。棕榈酸（PA）和油酸（OA）是常见的长链脂肪酸，可增加肝细胞内脂质聚积，诱发氧化应激反应，用于诱导细胞NAFLD模型。利拉鲁肽可抑制胰高血糖素样肽分泌，同时抑制β细胞凋亡、刺激β细胞的增殖和分化。研究证实，利拉鲁肽在降低血糖的同时对血脂代谢也有有益的调节作用，研究发现，利拉鲁肽可以改善肝细胞内质网的氧化应激水平，并且可以通过激活信号通路AMPK/mTOR/SREBP1增加自噬，从而改善肝脏脂肪变性。利拉鲁肽还可以通过增强高糖诱导的HepG2细胞的胆固醇流出、改善细胞内脂质聚积。目前关于糖尿病及肝脏损伤的研究主要集中于氧化应激、炎症和胰岛素信号传导通路，随着研究的深入，铁死亡在NAFLD发病中的作用及相关通路逐渐成为研究的热点。

铁死亡是一种新型的程序性细胞死亡方式，其特征为细胞内铁超载引发的氧化应激和细胞脂质过氧化。研究发现，铁死亡可导致单纯肝细胞脂肪变性向肝纤维化进展。NAFLD患者存在铁代谢异常和肝脏铁聚积，铁螯合剂能够改善NAFLD患者的肝脏病理，因此，抑制铁死亡可能成为治疗NAFLD的一种新策略。

具有多重作用的利拉鲁肽是否可通过抑制铁死亡改善NAFLD的肝脏病理变化，目前研究较少。本研究通过棕榈酸/油酸诱导HepG2细胞，探讨铁死亡是否参与NAFLD的发病机制，利拉鲁肽是否可通过抑制铁死亡发挥有益作用。

2.实验材料

实验用棕榈酸钠/油酸钠试剂盒（KC006）购自西安鲲创科技有限公司，其中：棕榈酸钠和油酸钠具有常温无析出、浓度准确，无需加热助溶等特点。利用商品化的细胞用高脂细胞添加剂，母液含有高浓度的游离脂肪酸，由于试剂本身为液态、无菌，能与完全培养基直接互溶用于实验，减少了旧方案使用乙醇、NaOH等助溶剂（助溶剂本身有细胞毒性，混杂了高脂试剂的作用）和溶解时的加热操作，节省了操作，增强了实验的稳定性。

3.实验方法

将HepG2 细胞分为对照组（Con组）：含有10% FBS的MEM培养基孵育细胞24h；游离脂肪酸组（FFA组）：终浓度为200μM/100μM的棕榈酸/油酸培养基孵育24h；利拉鲁肽干预组（FFA+LI组）：终浓度为 100nM的利拉鲁肽并含200μM/100μM的棕榈酸/油酸培养基，孵育细胞24h。分别检测各组细胞内甘油三酯含量，应用油红O染色方法观察细胞中脂质沉积情况；检测各组细胞内谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）的活性和铁含量。应用real-time PCR和蛋白质免疫印记电泳方法检测各组细胞催化亚基溶质载体家族7 成员11（SLC7-A11）、转录因子E2相关因子2（Nrf2）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、转铁蛋白受体1（TFR1）基因和蛋白的表达。

其中，部分核心方法的步骤如下：

（1）应用MTT方法检测不同浓度利拉鲁肽细胞存活率

1）HepG2细胞MEM培养基孵育达到80%融合率后，消化收集细胞，按照浓度5×10⁴/mL接种于96孔板内。

2）细胞贴壁后，更换培养基，细胞生长至80%时，吸取培养液。

3）溶剂对照组：加入100μL含有10%FBS的MEM培养基孵育；利拉鲁肽组：加入100μL含有不同浓度利拉鲁肽的MEM培养基孵育。利拉鲁肽终浓度为500nM、200nM、l00nM、50nM；空白对照组：不接种细胞，加入100μL含有10%FBS的MEM培养基。每组设4孔重复。

4）在培养箱内分别孵育24h和48h后，向各孔中加入20μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h，吸取培养基，每孔加入150μL DMSO，检测吸光值（490nm）。计算细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白对照组OD值）/(对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。

5）实验重复3次。

（2）应用MTT方法检测不同浓度棕榈酸/油酸细胞存活率

1)HepG2细胞MEM培养基孵育达到80%融合后，消化收集细胞，按照浓度5×10⁴/mL接种于96孔板内。

2)细胞贴壁后，更换培养基，细胞生长至80％时，吸取培养液。 

3)溶剂对照组：加入100μL含有10%FBS的MEM培养基孵育；棕榈 酸酸/油酸组：加入100μL含有不同浓度棕榈酸/油酸混合物的培养基孵育。棕榈酸/油酸终浓度为500μM/250μM、400μM/200μM、300μM/150μM、 200μM/100μM。空白对照组：不接种细胞，加入100μL含有10%FBS的 MEM培养基。每组设4孔重复。 

4)培养箱内分别孵育24h和48h后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h，吸取培养基，每孔加入150μL DMSO，检测吸光值（490nm）。

计算细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白对照组OD值）/(对照组OD值 -空白对照组OD值)×100%。

5）实验重复3次。

（3）实验分组

1)对照组（Con组）：含有10% FBS的MEM培养基孵育细胞24h。

2)模型组（FFA组）：终浓度为200μM/100μM的棕榈酸/油酸培养基孵育24h。

3)利拉鲁肽干预组（FFA+LI组）：终浓度为100nM的利拉鲁肽并含200μM/100μM的棕榈酸/油酸培养基孵育细胞24h。

4.实验结果

1）不同浓度棕榈酸/油酸对HepG2 细胞存活率的影响

给予HepG2细胞不同浓度的棕榈酸/油酸混合物（0、50/25、100/50、200/100、300/150、400/200 μmol/L），分别作用24h、48h后，采用MTT法测定各组细胞的存活率。以均数±标准差表示结果，分别作用24h、48h后，与对照组比较，浓度为300/150 μmol/L、400/200 μmol/L棕榈酸/油酸组HepG2细胞存活率显著下降（P<0.05）；浓度为50/25 μmol/L、100/50 μmol/L、200/100 μmol/L棕榈酸/油酸组HepG2细胞存活率无显著性差异（P>0.05）。选取其中最高浓度即200/100 μmol/L的棕榈酸/油酸混合物，进行后续细胞脂质积累和氧化应激模型的建立。

2）不同浓度利拉鲁肽对HepG2 细胞存活率的影响

不同浓度的利拉鲁肽（0、50、100、200、300、500 nmol/L）处理HepG2细胞，分别作用24h、48h后，用MTT法测定各组细胞的存活率。以均数±标准差显示结果，分别作用24h、48h后，与对照组比较，浓度为200 nmol/L、300 nmol/L、500 nmol/L利拉鲁肽组HepG2细胞存活率显著下降（P<0.05）；浓度为50 nmol/L、100 nmol/L的利拉鲁肽组HepG2细胞存活率均无统计学差异（P>0.05）。选取其中浓度最高即100 nmol/L利拉鲁肽用于后续细胞干预实验。

3）利拉鲁肽减少棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞中脂质含量

油红O染色结果表明，FFA组的HepG2细胞内橘红色脂滴比Con组显著增加；与FFA组比较，FFA+LI组HepG2细胞内橘红色脂滴显著减少,但仍高于Con组。HepG2细胞内甘油三酯含量测定以均数±标准差表示结果，与Con组相比，FFA组HepG2细胞内甘油三酯水平显著升高；与FFA组相比，FFA+LI组HepG2细胞内甘油三酯水平明显降低，但仍高于Con组（P<0.05）。提示棕榈酸/油酸可致HepG2细胞内脂质含量增加，而利拉鲁肽可降低细胞内脂质水平。

4）利拉鲁肽提高棕榈酸/油酸诱导的HepG2 细胞抗氧化应激能力，减少脂质过氧化

试剂盒检测HepG2细胞内SOD活性、GSH含量，以均数±标准差表示结果，与Con组相比，FFA组HepG2细胞内SOD活性、GSH水平显著降低；与FFA组相比，FFA+LI组HepG2细胞内SOD活性、GSH水平明显升高，但仍低于Con组（P<0.05）。提示棕榈酸/油酸可致HepG2细胞抗氧化应激能力降低，而利拉鲁肽可提高细胞的抗氧化应激能力。

与Con组相比，FFA组HepG2细胞内MDA显著升高；经利拉鲁肽干预后，FFA+LI组HepG2细胞内MDA水平显著低于FFA组，但仍高于Con组（P<0.05）。提示棕榈酸/油酸可致HepG2细胞脂质过氧化水平增加，而利拉鲁肽可降低细胞脂质过氧化水平。

随后，作用利用利拉鲁肽提高棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞抗氧化应激能力，减少脂质过氧化。并利拉鲁肽减少棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞内铁超载，利拉鲁肽上调棕榈酸/油酸诱导的HepG2 细胞Nrf2 和GPX4 mRNA 表达、下调TFR1 mRNA表达，并利用利拉鲁肽上调棕榈酸/油酸诱导的HepG2 细胞Nrf2 和GPX4 蛋白表达、下调TFR1 蛋白表达，具体内容请参见原文。

5.结论

1）棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞脂质含量增加，利拉鲁肽可减少肝细胞内脂质沉积。

2）棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞出现抗氧化应激能力降低、铁超载以及细胞脂质过氧化增加等铁死亡的特征；与铁死亡相关的蛋白SLC7A11、Nrf2、GPX4表达降低，TFR1表达增加，提示铁死亡参与了NAFLD的发病。

3）利拉鲁肽通过上调铁死亡相关蛋白Nrf2、GPX4 的表达，下调TFR1 的表达，提高棕榈酸/油酸诱导的HepG2 细胞的抗氧化应激能力、减轻细胞内铁超载、减少细胞脂质过氧化，抑制铁死亡。

小编有话说：

本研究使用棕榈酸/油酸联合诱导HepG2细胞的NAFLD模型。给予棕榈酸/油酸处理后，HepG2会出现脂质沉积、抗氧化应激能力下降、铁超载以及细胞脂质过氧化增加等铁死亡的特征，利拉鲁肽可逆转这一现象。本文从抑制铁死亡的角度，为NAFLD的干预治疗提供了一个新方法。

参考文献

肖艳新.利拉鲁肽对肥胖2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病患者肝脏脂肪含量的影响及机制研究 [D].河北医科大学, 2023(4).