人源肝癌细胞HepG2细胞脂质沉积模型的建立及其脂质代谢研究

人源肝癌细胞HepG2细胞脂质沉积模型的建立及其脂质代谢研究

中国中医药信息杂志/2025年 

1. 前言

2型糖尿病（type2diabetesmellitus，T2DM）是以血糖升高为特点的代谢性疾病，其并发症可累及全身多个靶器官功能障碍，已成为威胁人类健康的重大疾病之一。非酒精性脂肪性肝病（nonalcohol fatty liver disease，NAFLD）是T2DM临床常见慢性合并症，是以三酰甘油（TG）为主的脂质在肝细胞内过度沉积形成脂质液滴为特点。研究发现，T2DM患者合并NAFLD发生率超过60%，且该部分患者死亡风险显著升高，可能与NAFLD加剧脂质代谢紊乱，增加心血管疾病风险有关。

青钱柳是我国特有树种和宝贵中药资源，研究表明，青钱柳有调节血脂作用，但具体机制尚未阐明。胆固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）能通过调控脂肪酸合成酶（FAS）等关键酶影响脂质稳态，被认为是治疗NAFLD的潜在靶点。

课题组前期通过网络药理学预测发现，青钱柳可能通过调控PI3K/Akt信号通路治疗T2DM合并NAFLD。本研究采用棕榈酸钠诱导HepG2细胞建立脂质沉积模型，探讨青钱柳改善脂质代谢紊乱的作用机制，为临床治疗T2DM合并NAFLD提供实验依据。

2.实验材料

本文采用棕榈酸（钠）作为高脂细胞添加剂（货号KC002，Xi'an Kunchuang Technology, 西安鲲创科技）作为游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）完成体外细胞实验。采用可靠的高脂细胞添加剂，能够保证溶剂无毒、无菌、常温无析出、低温无析出、浓度精准，无需多次加热助溶，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。实际使用时，只需要将高脂细胞添加剂按照比例加入到完全培养基中即可。

3.实验方法

1）细胞培养及活力测定

HepG2细胞用DMEM高糖完全培养基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素），在普通培养箱（37℃、95%空气、5% CO₂）培养，隔日换液，待细胞融合度达到85%时，使用0.25%胰酶消化并传代。将处于对数生长期的HepG2细胞以5×10³个/孔接种于96孔板中，每孔100μL，待细胞生长至70%～80%融合时，弃去培养基，加入含不同浓度（2000、1000、500、250、100μg/mL）青钱柳水提液冻干粉的完全培养基，空白组不接种细胞，对照组加入不含药物培养基，每组5个复孔，分别于培养12、24h后加入CCK-8溶液10μL，培养箱避光孵育1h，酶标仪波长450nm检测各孔吸光度（OD值），计算细胞活力。

2）模型建立与分组

采用棕榈酸钠诱导 HepG2细胞模拟T2DM合并NAFLD体外模型。HepG2 细胞以5×10⁵个/mL接种在6孔板中，每孔2 mL，待细胞贴壁后，加入棕榈酸钠（150、250、350 μmol/L）， 分别于培养24、48 h后倒置显微镜下拍照观察，结合细胞内TG含量检测结果筛选造模浓度及时间。

根据CCK-8检测结果确定青钱柳低、中、高干预剂量，将细胞分为空白组、模型组（350μmol/L棕榈酸钠）、吡格列酮组（350μmol/L棕榈酸钠+3.92mg/L吡格列酮）、青钱柳低剂量组（350μmol/L棕榈酸钠+100μg/mL青钱柳冻干粉）、青钱柳中剂量组（350μmol/L棕榈酸钠+250μg/mL青钱柳冻干粉）、青钱柳高剂量组（350μmol/L棕榈酸钠+500μg/mL青钱柳冻干粉），每组5个复孔，先加入棕榈酸钠造模，再分别予相应浓度药物处理。

随后，进行尼罗红染色、BODIPY493/503荧光探针染色、ELISA检测、Western blot检测、qPCR检测等，详细步骤请参考原文。

4.部分实验结果

1）细胞形态学观察

DMEM高糖培养基培养12h后，可见多数HepG2细胞贴壁生长，呈上皮样形态，边缘清晰可见，细胞散在分布、尚未成团；培养24h后，部分细胞开始抱团生长；培养48h后，部分细胞叠加成小岛状，见图1。

2）造模条件筛选结果

150、250、350μmol/L棕榈酸钠干预HepG2细胞24h后细胞均贴壁生长，未见明显漂浮物及空泡细胞，形态无异常变化；48h后细胞生长状态较差，形态皱缩，可见明显细胞碎片。

150、250、350μmol/L棕榈酸钠干预HepG2细胞24h后检测细胞内TG含量，结果显示，150μmol/L棕榈酸钠组细胞TG含量与对照组差异无统计学意义（P>0.05），250、350μmol/L棕榈酸钠组细胞TG含量较对照组显著增加（P<0.01），350μmol/L棕榈酸钠组较250μmol/L棕榈酸钠组TG含量显著增加（P<0.01）；干预48h后，150μmol/L棕榈酸钠组细胞TG含量较对照组显著增加（P<0.01），250、350μmol/L棕榈酸钠组较150μmol/LPA组TG含量显著下降（P<0.01）。故选用350μmol/L棕榈酸钠诱导HepG2细胞24h造模。

3）青钱柳对HepG2细胞活力的影响

使用不同浓度青钱柳干预细胞12、24h，结果显示，干预12h后，与模型组比较，青钱柳100、250、500μg/mL细胞活力差异无统计学意义（P>0.05），青钱柳1000、2000μg/mL干预后细胞活力显著下降（P<0.01）；干预24h后，与模型组比较，青钱柳100μg/mL细胞活力差异无统计意义（P>0.05），其余4组细胞活力均显著降低（P<0.01）。故后续实验选择100、250、500μg/mL作为青钱柳低、中、高剂量，干预12h进行相关检测。见表3。

4）青钱柳对模型细胞脂质沉积的影响

尼罗红染色结果显示，空白组HepG2细胞脂质堆积较少；模型组HepG2细胞出现大量脂质堆积；吡格列酮组和青钱柳低、中、高剂量组细胞脂质沉积较模型组有不同程度改善。见图2。BODIPY493/503荧光探针结果与尼罗红染色趋势一致，见图3。

随后，还测试了青钱柳对模型细胞上清液炎症因子含量的影响、青钱柳对模型细胞 PI3K/Akt/SREBP-1/FAS 通路 及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响、青钱柳对模型细胞脂肪甘油三酯酶、CD36mRNA表达的影响等，详细结果请参考原文。

5.讨论

甘油三酯（TG）由甘油和脂肪酸组成，其在肝脏的异常沉积被认为是NAFLD的关键特征之一。棕榈酸是游离脂肪酸的重要组成部分，可通过上调CD36蛋白表达诱导肝脏TG积累，从而促进NAFLD发生。棕榈酸钠是棕榈酸的钠盐，对细胞脂肪生成和脂肪变性均有促进作用，常用于构建细胞模型。人源肝癌细胞株HepG2系一种表型与肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株，适用于肝细胞代谢方面的研究。因此，本研究使用350μmol/L棕榈酸钠诱导HepG2细胞脂质沉积，结果表明模型组细胞TG含量相较于正常细胞显著增加。

实验结果表明青钱柳冻干粉干预后可显著改善模型细胞脂质沉积，其机制可能与降低p-PI3K、p-Akt、SREBP-1、FAS蛋白表达水平，下调CD36mRNA并上调ATGLmRNA表达水平相关，提示青钱柳可能通过调控PI3K/Akt/ SREBP-1/ FAS信号通路改善脂质沉积，可能与促进TG分解、减少TG合成相关。此外，青钱柳冻干粉干预可显著降低细胞上清液TNF-α和IL-6含量，显著下调模型细胞Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，提示青钱柳可减轻PA诱导的HepG2细胞脂毒性水平，抗肝细胞凋亡。

小编有话说：

HepG2细胞脂质沉积与代谢紊乱改善是目前的研究热点，绝大数技术人员普遍采用的是500μmol/L棕榈酸（钠）联合250μmol/L油酸（钠）作用48至72小时的技术方案诱导HepG2细胞以建立NAFLD体外细胞模型，部分技术人员也会单独采用棕榈酸（钠）或油酸（钠）进行诱导，由于HepG2细胞本身较为敏感，部分情况下也能出现理想的实验结果，但总体来说，棕榈酸（钠）的核心作用是诱导细胞损伤和炎症，油酸（钠）的核心作用是诱导细胞脂质沉积，因此，在研究非酒精性脂肪性肝病时，更建议采用棕榈酸（钠）联合油酸（钠）的技术方案，使实验条件更符合人体环境且实验结果更为可靠。

参考文献

刘艺璇、吴昊洋等. 青钱柳对棕榈酸钠诱导的HepG2细胞脂质沉积的影响及作用机制[J], 中国中医药信息杂志,2025.