Metabolism（IF=11.9）游离脂肪酸（FFA）诱导小鼠肝细胞系（AML12）脂肪变性以建立肝细胞脂毒性模型

1. 技术背景

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球高发的慢性肝病，与肥胖、胰岛素抵抗及脂代谢紊乱密切相关。其核心病理机制涉及肝细胞脂毒性积累、炎症反应及纤维化进程，而AMP活化蛋白激酶（AMPK）作为能量代谢的核心调控因子，其功能失调会加剧脂质合成与氧化失衡。Imeglimin是一种新型口服降糖药，既往研究提示其可通过激活AMPK改善糖脂代谢，但针对MASLD的具体作用靶点及分子机制尚未明确。

2. 技术路线

本研究采用为期48周的高脂饮食喂养，构建了模拟人类MASLD疾病进展的小鼠模型。随后，对模型小鼠进行了为期6个月的Imeglimin干预，以评估其治疗效果。接下来，通过肝特异性Pen2基因敲除小鼠（Pen2-LKO）及AMPK抑制剂（CompoundC）验证靶点依赖性；结合RNA测序、分子对接及表面等离子共振（SPR）技术明确Imeglimin与Pen2的直接互作；进一步利用人iPS分化的肝样细胞（hPSC-HLCs）验证临床相关性。

细胞实验部分主要使用AML12小鼠肝细胞系及人iPS来源的肝样细胞，通过添加游离脂肪酸（油酸钠与棕榈酸钠混合）诱导脂质堆积，进而观察Imeglimin对脂质沉积、AMPK磷酸化及相关信号通路的影响，并利用Pen2敲除细胞及AMPK抑制剂验证其作用依赖性。细胞实验聚焦三部分：

1）AML12小鼠肝细胞系：以油酸钠（500μM）和棕榈酸钠（250μM）处理48小时诱导脂毒性模型，评估Imeglimin对脂滴积累（Nile Red染色）及AMPK通路的影响。 

2）原代小鼠肝细胞：从HFD小鼠分离，分析Imeglimin对脂代谢基因（Fasn、Srebp1c）的调控。

3）人iPS衍生肝样细胞：通过游离脂肪酸（FFA）诱导脂肪变性，验证Imeglimin的跨物种保护作用。

3. 游离脂肪酸

在体外模型中，研究采用棕榈酸钠、油酸钠为游离脂肪酸（FFA）处理AML12细胞，成功模拟了MASLD中肝细胞的脂质堆积状态。

该高脂细胞添加剂（KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。其中，棕榈酸钠可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸钠可以用来诱导细胞代谢异常。棕榈酸钠和油酸钠可以单独使用，也可以联合使用。需要说明的是，由于部分肝细胞较为敏感，某些情况下研究人员单独使用棕榈酸（钠）或油酸（钠）进行诱导也能获得理想的实验结果，但在研究代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）时，多数文献更推荐棕榈酸钠与油酸钠联合诱导的技术方案。

4. 核心细胞实验

在细胞层面的深入探究中，研究团队首先建立了稳定的肝细胞脂毒性模型。如图1所示，当AML12细胞暴露于游离脂肪酸混合物（油酸钠：棕榈酸钠 = 2:1）中48小时后，通过尼罗红染色可清晰观察到细胞内脂滴面积显著增加约12.3倍，细胞内甘油三酯含量也上升了1.6倍，成功模拟了MASLD中肝细胞的脂质堆积状态。而使用Imeglimin干预后，这些脂质积累被显著逆转，脂滴面积和甘油三酯含量均明显降低。

图1  Imeglimin通过Pen2/AMPK途径改善FFAs诱导的肝细胞脂质蓄积

为了阐明其作用机制，研究人员进一步检测了AMPK通路的激活情况。Western blot结果显示（如文中 Fig. 1C 所示），Imeglimin处理能剂量依赖性地增加AMPK的磷酸化水平，并同时增强胰岛素信号通路关键蛋白AKT、IRS-1和PI3K的磷酸化，提示其既能改善脂代谢也能增强胰岛素敏感性。

关键机制验证通过基因和药理学手段完成（相关结果整合于Fig.1系列图中）：如Fig.1D和E所示，当使用AMPK特异性抑制剂Compound C后，Imeglimin降低脂质积累的效应被完全阻断。同样，在Pen2功能缺失的细胞模型中（Fig.1G和H），Imeglimin的抗脂沉积作用也显著减弱，这直接证明了其抗脂毒性作用依赖于Pen2-AMPK轴。此外，该保护作用具有跨物种相关性，在人iPS细胞来源的肝样细胞中（Fig.1I和J），Imeglimin同样能够有效减轻FFA诱导的脂质沉积，进一步增强了研究发现向临床转化的说服力。

5. 总结

在本研究中，作者首先通过为期48周的高脂饮食喂养，构建了模拟人类MASLD疾病进展的小鼠模型。随后，对模型小鼠进行了为期6个月的Imeglimin干预，以评估其治疗效果。结果显示，Imeglimin治疗改善胰岛素抵抗，恢复肝功能，减轻肝脏炎症，促进肝细胞活性。Pen2是γ-分泌酶复合体的一个组分，被认为是Imeglimin的关键靶点。在肝脏特异性Pen2缺陷小鼠中，或当AMPK被药物抑制时，Imeglimin的治疗作用均被阻断，这提示其保护作用依赖于Pen2-AMPK信号通路的激活。此外，本研究还发现，Imeglimin能保护人多能干细胞(HPSC)来源的肝细胞样细胞，使其免受游离脂肪酸(FFA)诱导的脂质堆积。综上所述，本研究结果表明，Imeglimin通过靶向Pen2激活AMPK轴，从而减轻肝脏脂毒性，这一机制为其未来作为治疗MASLD的潜在新药提供了依据。

小编有话说：

本研究通过用500μM油酸钠与250μM棕榈酸钠的混合液处理AML12细胞48小时，有效诱导了细胞脂质沉积模型。Imeglimin的干预显著缓解了这一过程，其机制被证实依赖于与靶蛋白Pen2的结合，进而激活AMPK信号通路，并协同增强胰岛素信号。这一系列系统的细胞水平验证，为理解Imeglimin的肝保护作用提供了坚实的体外证据。

本研究中所采用的高纯度油酸钠与棕榈酸钠，作为诱导肝细胞脂毒性及脂质沉积的金标准试剂，其稳定的质量和可靠的效价为实验结果的准确性奠定了坚实基础。相关试剂供应商持续致力于为代谢性疾病前沿研究提供优质、可靠的细胞模型诱导工具，助力像Imeglimin作用机制这类重大科学发现的实现，推动MASLD等代谢性疾病治疗新策略的开发与转化。

参考文献

LI J, ZHANG R, ZENG X, et al. Imeglimin ameliorates MASLD by targeting Pen2 to activate AMPK pathway[J/OL]. Metabolism, 2026, 175: 156458. DOI:10.1016/j.metabol.2025.156458.