Oncogenesis（JCR Q1；IF 6.4）游离脂肪酸（FFA）诱导肝癌细胞（Huh7、SK-Hep-1）脂质积累以建立高脂细胞模型

1. 技术背景

肝癌（HCC）是一种高发病率与高死亡率的恶性肿瘤，其发生发展与代谢重编程，尤其是脂质代谢异常密切相关。脂肪酸合成酶（FASN）是催化棕榈酸（PA）从头合成的限速酶，在肝癌中常高表达，并促进肿瘤生长和转移。蛋白质的稳定性受到泛素化修饰的精密调控。去泛素化酶（DUBs），如USP5，能够通过移除泛素链来稳定其靶蛋白，已在多种癌症中被证实具有促癌功能。然而，USP5是否通过调控脂质代谢的关键酶FASN来影响肝癌进展，目前尚未完全阐明。本研究旨在探索USP5是否通过介导FASN的去泛素化以稳定其蛋白水平，从而促进PA合成并驱动肝癌的恶性进展。

2. 技术路线

本研究首先利用临床样本与公共数据库（如TCGA）进行生物信息学分析，明确USP5在HCC组织中的表达谱及其与患者临床预后的相关性。随后，在Huh7和SK-Hep-1肝癌细胞系中构建USP5稳定敲低及过表达模型，通过功能实验系统验证USP5对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭及脂质积累等恶性生物学进展的影响。进而，综合利用蛋白质组学、免疫共沉淀（Co-IP）以及泛素化修饰分析等手段，深入揭示了USP5与FASN之间的直接相互作用及前者对后者蛋白稳定性的调控机制。最后，通过建立小鼠皮下移植瘤模型，在体水平进一步证实了USP5-FASN信号轴在促进HCC肿瘤生长中的关键作用。

细胞水平的功能与机制研究是本文的核心内容。研究采用慢病毒感染技术，成功构建了USP5稳定敲低和过表达的Huh7与SK-Hep-1细胞株。通过CCK-8实验、克隆形成实验及Transwell实验系统评估了细胞的增殖与侵袭转移能力；采用油红O（Oil Red O）与尼罗红（Nile Red）染色并结合脂质组学分析，明确了细胞内脂质积累程度及脂肪酸谱的变化；进一步利用蛋白酶体抑制剂MG132处理、放线菌酮（CHX）蛋白合成抑制追踪实验以及泛素化免疫沉淀等技术，深入阐明了USP5通过去泛素化作用维持FASN蛋白稳定的具体机制。

3. 游离脂肪酸（FFA）处理与高脂模型建立

在体外模型中，研究采用棕榈酸钠、油酸钠为游离脂肪酸（FFA）处理Huh7和SK-Hep-1两种肝癌细胞系，成功模拟了MASLD中肝细胞的脂质堆积状态。

该高脂细胞添加剂（KC006）包括了独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠和12 mmol/L油酸钠以及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用，具备溶剂无毒、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶等优点，显著减少操作步骤，提升实验的稳定性。其中，棕榈酸钠可以用来诱导细胞损伤和炎症，油酸钠可以用来诱导细胞代谢异常。棕榈酸钠和油酸钠可以单独使用，也可以联合使用。需要说明的是，由于部分肝细胞较为敏感，某些情况下研究人员单独使用棕榈酸（钠）或油酸（钠）进行诱导也能获得理想的实验结果，但在研究代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）时，多数文献更推荐棕榈酸钠与油酸钠联合诱导的技术方案。

4. 细胞实验结果

1）USP5正向调控HCC细胞的恶性生物学进展

Western blot分析证实，两条靶向USP5的特异性shRNA（shUSP5-1与shUSP5-2）均能在Huh7和SK-Hep-1细胞中实现高效的USP5蛋白敲低。系列功能实验结果表明，敲低USP5能显著抑制HCC细胞的增殖活性（CCK-8曲线显示吸光度增长放缓）、克隆形成潜能（形成的细胞集落数量明显减少）以及迁移与侵袭能力（Transwell实验显示穿过滤膜的细胞数目显著降低）。反之，在细胞中过表达USP5则能显著增强上述增殖、克隆形成及侵袭转移的恶性表型。这些结果共同证实USP5是驱动HCC细胞恶性进展的关键因子。

2）USP5通过重塑脂质代谢促进HCC进展

本研究创新性地揭示了USP5对HCC细胞脂质代谢的调控作用。对癌症基因组图谱（TCGA）数据的深入分析揭示，USP5的高表达水平与脂肪酸降解通路的基因集富集分数呈显著负相关（见图1A），这提示USP5可能抑制肝癌细胞的脂肪酸分解代谢。在细胞实验层面，敲低USP5可导致细胞内脂滴含量急剧减少：油红O染色显示胞内红色脂滴的着色面积与强度显著下降（图1B）；尼罗红染色也观察到类似的荧光强度减弱现象（图1C），共同证实了USP5敲低导致细胞内中性脂质储存能力受损。进一步的脂质组学非靶向/靶向分析定量揭示了脂肪酸谱的显著改变：USP5敲低后，以PA为代表的饱和脂肪酸（SFA）含量明显降低，而部分多不饱和脂肪酸（PUFA， 如亚油酸）的相对丰度则呈现上升趋势（图1D）。这种代谢谱的改变可能与肿瘤细胞为满足快速增殖而偏好利用饱和脂肪酸的代谢需求相悖。

3）外源性补充PA验证USP5-FASN轴的功能依赖性

为了明确棕榈酸（PA）是否是USP5发挥促癌功能的关键下游效应分子，研究者设计了关键性的外源性补充PA实验。在USP5敲低的Huh7细胞培养基中外源性添加0.25 mM的PA后，观察到细胞的增殖速率得到部分恢复（图1E），同时，Transwell实验显示其迁移与侵袭能力也呈现一定程度的回升（图1F）。定量分析显示，在Transwell侵袭实验中，经PA处理的USP5敲低组，其穿膜细胞数相较于未处理的敲低组增加了约50%，然而仍未恢复到阴性对照组（shNC）的水平。这一结果有力地证实，PA是USP5下游一个至关重要的效应分子，介导了USP5的部分促癌功能。同时，这也提示USP5的致癌效应可能还通过其他并行或交叉的信号通路来实现，而非完全依赖于PA。

图1  USP5调节肝癌细胞中的脂质积累和代谢

4）USP5通过去泛素化稳定FASN以调控PA合成

为了从分子机制上解释上述表型，研究者通过免疫共沉淀联合质谱（Co-IP/MS）分析，鉴定出脂肪酸合成酶（FASN）是USP5的一个关键相互作用蛋白。后续的Co-IP实验在Huh7和SK-Hep-1细胞中均证实了USP5与FASN之间存在直接的物理性相互作用。深入的机制探索发现，敲低USP5会导致FASN蛋白的泛素化修饰水平显著升高，并加速其经由蛋白酶体途径的降解；反之，过表达USP5则能够减少FASN的泛素化，有效延长其蛋白半衰期。对收集的HCC临床组织样本进行免疫组化（IHC）分析发现，USP5与FASN的蛋白表达水平在组织间呈现出显著的正相关关系。更为重要的是，在体动物实验中，给予USP5敲低的肿瘤细胞过表达FASN，能够部分挽救因USP5缺失而导致的皮下移植瘤生长抑制表型。综上所述，本部分研究证实了USP5通过其固有的去泛素化酶活性，直接结合并拮抗FASN蛋白的泛素化降解，从而稳定FASN蛋白水平、促进其催化的PA从头合成，最终驱动肝癌的恶性进展。

5. 总结

本研究发现去泛素化酶USP5在肝细胞癌组织中显著高表达，且与肿瘤大小、卫星结节、血管侵犯等不良病理特征及患者预后不良密切相关。功能上，USP5能促进肝癌细胞在体外的增殖、迁移、侵袭及脂质积累，并在体内加速肿瘤生长。机制上，USP5直接结合并去泛素化脂肪酸合成酶（FASN），抑制其泛素化降解，从而稳定FASN蛋白水平，导致其产物棕榈酸（PA）含量升高。PA可部分介导USP5的促癌效应。临床样本分析显示USP5与FASN表达呈正相关。因此，本研究揭示了一条全新的USP5-FASN-PA信号轴在肝癌进展中的关键作用，提示靶向该轴（如开发USP5或FASN抑制剂）可能成为肝癌治疗的一种潜在新策略。

小编有话说：

本研究中，为在体外模拟高脂微环境并验证棕榈酸（PA）的生物学功能，研究者采用0.25 mM棕榈酸钠（PA）与0.5 mM油酸钠（OA）的混合溶液处理细胞24小时。整个实验流程，包括细胞常规培养、慢病毒感染与嘌呤霉素筛选稳定细胞株、游离脂肪酸（FFA）刺激干预、以及后续的油红O/尼罗红染色等，均严格遵循文中详实的材料与方法部分所述的标准操作规范。PA作为FASN催化合成的核心终产物，其在此研究中被证实的促癌功能，有力凸显了靶向USP5-FASN-PA这一代谢信号轴在肝癌治疗策略开发中的潜在应用价值。

本研究中所使用的、用于高效诱导细胞脂质积累的棕榈酸钠和油酸钠来源于鲲创生物（Kunchuang Biotechnology）。其提供的即用型高脂细胞添加剂具有高纯度、严格无菌、水溶性佳和稳定性高等特点，为细胞脂质代谢研究提供了可靠且便捷的工具。该试剂有助于标准化高脂细胞模型的建立，可广泛应用于肿瘤代谢、药物筛选、脂肪肝疾病机制等研究领域。未来，探索此类高质量试剂在与靶向USP5或FASN的抑制剂联合治疗研究中的应用，将有助于推动肝癌代谢干预策略向临床转化。

参考文献

FANG Q, LUO C, LU Y, et al. Stabilization of FASN by USP5-mediated deubiquitination promotes hepatocellular carcinoma progression[J/OL]. Oncogenesis, 2025, 14(1). DOI:10.1038/s41389-025-00589-8.