CTM（IF 7.9）：棕榈酸钠/油酸钠联合诱导原代肝细胞、AML12细胞和THLE-2人肝细胞建立MAFLD体外细胞模型

1. 研究背景

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）已成为全球最常见的慢性肝病之一，其核心特征包括肝细胞脂质蓄积、肝损伤、炎症浸润及不同程度的纤维化，并可向代谢功能障碍相关脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌进展。高热量饮食、肥胖和脂质代谢紊乱是重要驱动因素，但当前仍缺乏特异性药物，治疗多局限于生活方式干预、病因控制和终末期肝移植。因此，阐明MAFLD脂质蓄积的分子机制具有重要临床意义。长链非编码RNA（lncRNA）可通过与DNA、RNA和蛋白互作参与染色质重塑、转录调控和RNA稳定性调节，在MAFLD中的作用日益受到关注。SNHG5（小核仁RNA宿主基因5）含6个外显子，可编码U50和U50'小核仁RNA，既往被证明参与细胞增殖、凋亡和肝星状细胞活化，并在肝纤维化中作为促纤维化因子，但其在MAFLD中的功能尚不清楚。与此同时，乳酸不再仅是糖酵解副产物，还可作为底物介导赖氨酸乳酰化，既修饰组蛋白，也修饰非组蛋白；MCT1等单羧酸转运体调控乳酸转运，P300、HBO1等酰基转移酶参与乳酰化。ARID1A作为染色质重塑复合物组分，与肝脏脂质代谢和MAFLD密切相关。基于此，本文聚焦SNHG5-MCT1-乳酸-ARID1A K391乳酰化轴，探索MAFLD进展的新机制。

2. 技术和方法

围绕这一科学问题，本文的技术路线从表达验证、功能获得/缺失、机制筛选到体内回复验证逐步展开。研究者先建立高脂饮食和高脂高胆固醇饮食小鼠模型，以及棕榈酸钠/油酸钠混合物诱导的原代肝细胞、AML12细胞和THLE-2人肝细胞模型，检测SNHG5表达变化；随后通过过表达和敲低SNHG5观察脂滴、甘油三酯、肝损伤标志物及脂合成基因变化。为寻找下游机制，对过表达SNHG5的原代肝细胞进行RNA测序，发现糖酵解/糖异生通路和MCT1显著改变；再通过MCT1过表达、敲低及回复实验验证其功能。进一步结合乳酰化组学和蛋白组学，筛选ARID1A K391为关键乳酰化位点，并用K391R突变、P300/HBO1敲低及体外乳酰化实验验证。最后，利用肝细胞特异性SNHG5敲除和SNHG5/MCT1双敲除小鼠，在体内确认该轴对MAFLD进展的作用。

3. 高脂细胞添加剂

在体外细胞模型中，使用棕榈酸钠和油酸钠作为高脂细胞添加剂处理原代肝细胞、AML12细胞和THLE-2人肝细胞模型以建立MAFLD体外细胞模型。棕榈酸钠常用来诱导细胞损伤和炎症，油酸钠常用来诱导细胞代谢异常，两者联合更接近体内混合脂肪酸暴露状态，适用于多数常见细胞，可用于诱发细胞脂毒性、诱导内质网应激、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡等。

该高脂细胞添加剂（货号KC006）包含独立包装的6 mmol/L棕榈酸钠、12 mmol/L油酸钠及溶剂对照，试剂为无菌液体，能够直接使用。与其他现有品牌的棕榈酸相比，具有溶剂无毒、常温无析出，冻融无析出，无需加热助溶、浓度准确、能够呈现清晰的剂量依赖性趋势等显著优势。

实际使用时，棕榈酸钠和油酸钠可以采用如下比例，直接加入完全培养基，无需额外操作。

油酸钠：母液浓度12 mmol/L→作用浓度0.5 mmol/L，稀释了24倍； 

棕榈酸钠：母液浓度6 mmol/L→作用浓度0.25 mmol/L，稀释了24倍； 

24份总体积=1份油酸（钠）+1份棕榈酸（钠）+22份完全培养基； 

此时，以1.2 mL为例，油酸钠加1.2/24=0.05 mL，棕榈酸钠加1.2/24=0.05 mL，其余为完全培养基。以1mL为例，油酸钠加1/24=0.0417 mL，棕榈酸钠加1/24=0.0417 mL，其余为完全培养基。

处理时间上可通过镜下观察细胞状态初步判断，一般24-48小时为宜。

4. 部分实验内容和结果

细胞实验是连接分子机制与体内表型的关键环节。本文使用小鼠原代肝细胞、AML12小鼠肝细胞系和THLE-2人肝上皮细胞，在体外模拟MAFLD。细胞处理方面，采用KC006高脂细胞添加剂，即棕榈酸0.25 mmol/L与油酸0.5 mmol/L组成的PO混合物，诱导肝细胞脂质蓄积；同时用pcDNA3.1载体过表达SNHG5或MCT1，用shRNA/siRNA敲低SNHG5、MCT1、P300或HBO1，并用Lipofectamine 3000转染48小时。检测指标包括油红O和尼罗红染色观察脂滴、细胞内甘油三酯和乳酸水平、培养上清AST/ALT、qRT-PCR和Western blot检测Srebp1、Fasn、Acc等脂合成基因，以及RIP、RNA pull-down、乳酰化Western blot和ARID1A K391R突变实验。这些细胞实验为后续机制阐述提供了直接证据。

如图1所示，图中展示了PO混合物处理的原代肝细胞和AML12细胞中油红O与尼罗红染色增强，脂滴明显增多，同时SNHG5表达显著升高；在HFD和HFHC小鼠肝组织及MAFLD患者血清中，SNHG5也呈高表达，并与ALT、AST和NAS评分正相关。这说明高脂细胞添加剂KC006诱导的PO模型能够较好复现MAFLD中SNHG5上调的特征。实验数据展示了sh-SNHG5处理后原代肝细胞油红O和尼罗红染色脂滴减少，培养上清AST、ALT下降，细胞内TG降低，Srebp1、Fasn和Acc的mRNA及蛋白表达下调；在体内，SNHG5敲除小鼠同样表现出脂滴减少、肝损伤减轻和脂合成基因下降。这一部分将细胞高脂模型与动物模型衔接起来，说明SNHG5是脂质蓄积的正向调控因子。

图1. 小核仁RNA宿主基因5在体内和体外代谢功能障碍相关脂肪性肝病中的表达升高

如图2所示，图中展示了SNHG5过表达原代肝细胞的RNA测序结果，KEGG富集显示糖酵解/糖异生通路最显著，火山图和热图提示Slc16a1（编码MCT1）显著下调；Western blot也证实MCT1蛋白下降。功能上，MCT1过表达可逆转SNHG5诱导的脂滴增多、AST/ALT升高、TG积累和细胞内乳酸升高。这说明SNHG5通过下调MCT1影响乳酸代谢，而KC006诱导的PO高脂环境使这一代谢轴更容易显现。实验数据展示了SNHG5主要位于细胞质，RIP和RNA pull-down证实其与MCT1蛋白结合，且0-300 nt区域是结合MCT1所必需；缺失该区域的SNHG5-Δ1-300不能下调MCT1，也不能促进脂滴积累，而敲低MCT1可恢复脂滴积累。该结果在细胞水平上证明了SNHG5与MCT1的直接互作是脂质蓄积的重要环节。

图2. 小核仁RNA宿主基因5(SNHG5)通过MCT1调节乳酸，促进脂质积累

乳酰化组学与蛋白组学联合分析结果得出：在SNHG5过表达原代肝细胞中筛选出389个乳酰化上调而总蛋白不变的候选分子，ARID1A乳酰化升高最显著；共检测到33524个可定量乳酰化位点，其中24170个为高可信Class 1位点，亚细胞定位以细胞核和细胞质为主。进一步发现ARID1A K391和K985位点变化显著，K391R突变可明显降低ARID1A乳酰化，而K985R影响不明显。亚细胞组分Pan-Kla Western blot显示SNHG5主要增加细胞质乳酰化，MCT1过表达可逆转这一效应；外源乳酸可进一步增强ARID1A乳酰化。此外，ARID1A-K391R突变可明显逆转SNHG5诱导的油红O和尼罗红脂滴积累，降低Srebp1、Fasn、Acc的mRNA和蛋白表达，并减少AST、ALT和细胞内TG。这说明K391乳酰化是SNHG5促脂质合成的关键修饰位点。

如图3所示，图中展示了SNHG5过表达上调P300和HBO1的mRNA及蛋白表达；敲低P300可部分降低ARID1A乳酰化，而敲低HBO1则显著抑制ARID1A乳酰化。体外重组P300和HBO1乳酰化实验进一步证明，两者均可直接催化ARID1A乳酰化，并在乳酸存在时增强。实验结果展示了肝细胞特异性SNHG5敲除小鼠在HFD下脂滴、炎症和纤维化减轻，而SNHG5/MCT1双敲除可逆转这些保护效应，并恢复脂合成基因、ALT/AST、TG和Kla水平。THLE-2人肝细胞中，SNHG5敲低降低PO诱导的AST和TG，MCT1过表达逆转SNHG5诱导的乳酸积累，ARID1A-K391R和P300/HBO1敲低同样降低ARID1A乳酰化，说明该机制在人和小鼠肝细胞中具有保守性。这些细胞实验共同表明，KC006诱导的PO高脂模型是解析SNHG5-MCT1-乳酸-ARID1A乳酰化轴的重要工具。

图3. 小核仁RNA宿主基因5(SNHG5)通过P300和HBO1促进ARID1A乳酰化

5. 总结

代谢功能障碍相关性脂肪肝(MAFLD)是一种常见的以脂代谢异常为特征的慢性肝病。小核仁RNA宿主基因5(SNHG5)参与细胞增殖和凋亡的调节，是肝纤维化的促纤维化因子。然而，它在MAFLD中的作用尚不清楚。本研究旨在阐明SNHG5在MAFLD进展中的作用。在MAFLD进展过程中SNHG5的表达显著升高，而SNHG5抑制则抑制脂质堆积。对过表达SNHG5的原代肝细胞进行的转录测序显示，关键的乳酸转运体单羧酸转运体1(MCT1)的表达显著下调。乳酰化蛋白质组学和蛋白质组学的综合分析进一步表明，SNHG5的过表达促进了K391上非组蛋白富含AT的相互作用结构域1A(ARID1A)的乳酰化，从而推动了过度的脂质积累。酰基转移酶分析表明，P300和HBO1都参与了SNHG5介导的ARID1A乳酰化。在体内，与SNHG5缺陷小鼠相比，肝细胞特异性SNHG5基因敲除显著抑制了肝脏脂质堆积和MAFLD进展，而同时肝细胞特异性缺失SNHG5和MCT1恢复了脂质堆积。SNHG5通过诱导MCT1介导的ARID1AK391乳酰化，促进脂肪堆积和MAFLD进展。

小编有话说：

本文有关高脂细胞添加剂的实验主要围绕KC006油酸钠/棕榈酸钠类PO混合物展开：在原代肝细胞、AML12和THLE-2细胞中，以棕榈酸0.25 mmol/L和油酸0.5 mmol/L诱导脂质蓄积，再结合SNHG5、MCT1、P300、HBO1过表达或敲低，以及ARID1A K391R突变，检测油红O/尼罗红、TG、AST/ALT、乳酸、脂合成基因和乳酰化蛋白。原代肝细胞使用专用完全培养基，AML12使用商品化完全培养基，均在37°C、5% CO₂培养；PO混合物按KC006说明配制，转染使用Lipofectamine 3000，48小时后收获细胞。该处理方案重复性好，能稳定诱导MAFLD细胞表型。

展望而言，KC006油酸钠、棕榈酸钠高脂细胞添加剂为MAFLD体外建模提供了便捷、稳定的工具，适合机制研究和候选药物筛选。鲲创科技（Kunchuang Technology）的KC006产品配比明确、批次稳定，可帮助研究者高效构建肝细胞脂质蓄积模型，推动SNHG5-MCT1-乳酸乳酰化轴及更多MAFLD靶点的转化研究。

参考文献

Li, X.; Jiang, F.; Fang, B.; Lin, L.; Zheng, J.; Chen, T. Role of LncSNHG5 in MAFLD: Mechanisms of ARID1A K391 Lactylation and Lipid Accumulation. Clinical and Translational Medicine 2026, 16 (7). https://doi.org/10.1002/ctm2.70740.